בידוד של CD4+ תאי-T וניתוח של מחזורי Helper T-הזקיקים (cTfh) קבוצות משנה תא מ באמצעות דם היקפיים של Cytometry זרימה 6-צבע
Summary
. הנה, עבור בידוד ואפיון של CD4 פרוטוקול+ T-cell קבוצות משנה של דם היקפיים אדם מתואר. לטהר CD4+ תאי-T הם נותחו על ידי cytometry זרימה כדי לקבוע את הפרופורציות של T-הזקיקים תא מסייע קבוצות משנה.
Abstract
חריגה הזקיקים-T helper (Tfh) תא לזיהוי של מחלות אוטואימוניות ולא נוכחותם קשורה עם התוצאות הקליניות כאשר הצומת לימפה microenvironment ב B-cell לימפומה שאינה הודג’קין של ניתוח. קבוצות משנה של מחזורי T-helper תאי (cTfh), תא זיכרון מחזורי Tfh תאים בדם, הם גם מוטרד במחלה, לפיכך מייצגות פוטנציאל סמנים ביולוגיים חזוי הרומן. בדיקות מבוססות-דם היקפיים היא יתרון כי היא יחסית לא פולשנית, מאפשר ניטור טורי פשוטה. מאמר זה מתאר שיטה אנליטית CD4+ תאי T-דם אנושי, ולאחר ניתוח נוסף מאת cytometry זרימה לספור תאים cTfh, את הפרופורציות של קבוצות משנה שונים שלהם (cTfhPD-1-/ + / שלום, cTfh1, 2, 17 ו- cTfh1/17). הרמה של קבוצות משנה אלה השוו בין נושאים נורמליים, חולים עם לימפומה. מצאנו כי שיטת הפעולה היתה יציבה מספיק כדי להשיג תוצאות אמינות של החומר המטופל שנאספו באופן שגרתי. הטכניקה שנתאר לניתוח ניתן להתאים בקלות מיון תא ויישומים במורד הזרם כגון RT-PCR.
Introduction
T-helper תאי (Tfh) הם CD4+ משנה T-cell שאפיינו היה בתחילה רקמות הלימפה1. תאים אלה מביעים PD-1 קולטנים משטח CXCR5, מפרישים IL-21 ו- IL-4 ולהראות ביטוי הגרעין של הגורם שעתוק, BCL-62,3. כפי שמרמז שמם, הם נמצאים במרכזים נבטי, הם חיוניים עבור ייצור נוגדנים זיקה גבוהה1.
תגובות Dysregulated Tfh היו מעורבים בפתוגנזה מחלה, מחלות אוטואימוניות שהבולט, איפה הם מקדמים את התרחבות autoreactive B תאים4. הם גם לשחק תפקיד microenvironment הגידול של סרטן הלימפה7והן מוצק5,6 . לעומת זאת, פגמים גנטיים של חלבונים פני שטח חיוני Tfh לתפקד כמו התוצאה costimulator (ICOS) T-cell inducible הכשל החיסוני האנושי תסמונות8. CD4+ CXCR5+ בתאי דם היקפיים אדם מכונים במחזור T-helper תאי (cTfh), מאמינים כי תא זיכרון Tfh תאים ברקמות9. מטרת השיטה המתוארת כאן היא הניתוח של קבוצות משנה cTfh בעקבות CD4+ תא בידוד של דגימות דם היקפיים.
מספר קבוצות משנה cTfh הוגדרו, היעילות שבה הם מספקים עזרה B-cell שונה משנה אחת עוד9,10,11,12. כמויות יחסיות של קבוצות משנה אלה שונו במספר מחלות, לרוב בצורה בולטת מחלות אוטואימוניות שבו שם הוא כמעט תמיד עלייה יחסית יותר פונקציונלי PD-1/ היי ו/או קבוצות משנה cTfh2 או cTfh17, לעומת הפחות משטרת פונקציונלי-– 1 ו/או קבוצות משנה cTfh112. היקף השינויים הללו לעתים קרובות לשייך פרמטרים קליניים, כולל מחלת titers פעילות של נוגדן עצמי, המעידים על תפקיד אפשרי של התפלגות משנה cTfh כמו סמן prognostic במחלה, אשר עשוי לשקף את הפעילות של Tfh ב רקמות הלימפה9,12,13,14. בנוסף, לקחת דגימות דם המשתתפים זו קביל, מהירה ובטוחה, ומאפשר אז טורי ניטור לניתוח של התקדמות המחלה או תגובה לטיפול.
השימוש של CD4 מבודד+ תאי-T על המתלים תאי תא (PBMNC) המסורתית דם היקפיים מאפשר גבוה יותר תפוקה לזרום cytometry ניסויים על-ידי צמצום הזמן הנדרש כדי לרכוש מספר ניכר של תאים cTfh לניתוח. אפשרות זו שימושית במיוחד בעת מיון תאים cTfh נדיר קבוצות משנה באמצעות זרימת הפעלת התא מיון (FACS). לסייע את היעילות, תרחיפים אלה יכול להיות cryopreserved כדי לאפשר “אצווה” של דגימות ייעשה הניסוי cytometry זרימה. על בדיקות, CD4 את+ טוהר לא נוכה הקפאה קריוגנית.
בעוד מעבדות שונות נעשה שימוש סמנים שונים כדי סיווג חלוקה לקטגוריות cTfh תאים בשלבים המוקדמים של גילוין, השיטה המוצגת כאן עושה שימוש ערכה אחידה של שתי קבוצות של תאים-פני סמני כפי שהוצע על ידי שמידט ואח12, 15 כדי לאפשר זיהוי סימולטני cTfh ו שלהם קבוצות משנה מוכרת תשע ב cytometry זרימה יחיד הניסוי.
היחידה סמני פני שטח התא משמשים, התאים אינם מצריכים קיבוע או permeabilization, ולכן יכול להישאר בחיים ללימודי פונקציונלי במורד הזרם. זה יכול להיות בהנחייתם של התא מיון באמצעות FACS באותו פאנל נוגדן. לוח זה יכול להיות מורחבת לכלול סמנים אחרים, ומאפשר ההגבלות של cytometer זרימת בשימוש.
הניתוח של ניסויים cytometry זרימה צבע רב יכול להיות מאתגר בשל אופיו מטבעם סובייקטיביות של gating על נקודה 2-ממדי חלקות, במיוחד כאשר אוכלוסיות תאים שאין התפלגות ברורה bi-מודאלי סמן פלורסצנטיות, כמו גם במקרה של תאים cTfh, קבוצות משנה שלהם. מסיבה זו, זה הכרחי כדי להגדיר את הפקדים יעיל כדי להפחית את חפצי אמנות כדי לאפשר רזולוציה טובה יותר של אוכלוסיות וכדי להגדיר gating אסטרטגיות בביטחון. ככזה, עיצוב לוח נוגדן, את הסידור של פקדים בסיסיים עבור cytometry זרימה הניסוי, קרי, באמצעות פיצוי, FMO הפקדים יוקפו בקו שלב 3.4.2 ועל 3.4.3,respectively.
כל התאים cTfh מוגדרים CD4+ CXCR5+ CD45RA–. ניתן לקבוע את רמת הביטוי של דה מרקר הפעלה האופיינית Tfh PD-1 ואז לזהות תת-קבוצות של PD-1–, PD-1+ או PD-1היי cTfh תאים. לאחר מכן, באמצעות שילוב של קולטני כימוקין CXCR3 ו CCR6, אשר מתבטאים באופן שונה על ידי Th1 מסורתיים, 2 או 17 תאים, cTfh שניתן לאפיין cTfh1, 2 או דמוי-17 על ידי פרופיל של CXCR3+ CCR6–, CXCR3– CCR6– , ו CXCR3– CCR6+, בהתאמה.
לוח הנוגדן בשימוש על ידי המעבדה שלנו מוצג בטבלה1. המשתמש, ייתכן שיהיה עליך להתאים את הבחירה שלהם fluorophore לקחת בחשבון הלייזר ואת תצורת המסנן קלות זמינים על cytometer זרימה המקומי שלהם.
השיקולים הבאים להשפיע על בחירתו של fluorophores. השתמש fluorophores בהיר במידת האפשר. בפרט, להשתמש fluorophores זמין המבריקים של הסמנים (ביטוי פחות מאוד) dimmest. סמני דימר כוללים PD-1, CXCR3, CCR6, וכדי במידה פחותה CXCR5. אנחנו ספציפית הפך השימוש החדשים BB, BV, שתקנה לעצמך fluorophores אשר לספק בהירות מצוינת, ובכך לאפשר פתרון קל יותר של אוכלוסיות שונות של תאי.
מורחים את הבחירה fluorophore על פני ספקטרום פליטה ככל האפשר למזער חפיפה ספקטרלי וכך רמת הפיצוי הנדרש. כלי מקוון חינם, ניתן להשתמש כדי לסייע בתכנון לוח cytometry זרימה ניתן למצוא כאן: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. כדי לחסוך מקום על ספקטרום הפליטה, אנחנו מועסקים “ערוץ ה-dump” באמצעות צבע הכדאיות עם אורך גל פליטה החופפים עם זה של APC-H7 (מצומדת כדי CD45RA) כדי לאפשר את איתור (להדרה) של שניהם מתים ו/או CD45RA+ שימוש גלאי יחיד.
. הנה, פרוטוקול מוצג הבידוד של דם היקפיים CD4+ תאי-T וניתוח עוקבות שלהם על-ידי cytometry זרימה כדי לקבוע את הפרופורציות של שונות, תיאר לאחרונה במחזור קבוצות משנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מייצג דרך פשוטה ויעילה כדי לנתח את היקפי cTfh כדוריות הדם, המאפשר הזיהוי של כל קבוצות משנה רלוונטיים שזוהו עד כה בספרות. דגימות דם ניתן בקלות וביעילות להשיג כפי ניתן לאסוף חלק סטנדרטי-חולה מרפאות ודוגמאות טורי במקביל נתונים קליניים. בתורו, פעולה זו מאפשרת מחקרים להערכת ערכות משנ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמך על ידי מענק של לוקמיה בבריטניה ETB ו MJA.
Materials
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL TECHNOLOGIES | 15062 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17144003 | |
| BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3 | BD Horizon | 565223 | |
| BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9 | BD Horizon | 563923 | |
| BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2 | BD Horizon | 562747 | |
| BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone RPA-T4 | BD Horizon | 564419 | |
| PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4 | BD Pharmingen | 557946 | |
| APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone HI100 | BD Pharmingen | 560674 | |
| LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | ThermoFisher Scientific | L34973 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD CompBead | 552843 | |
| FACS Aria II Flow Cytometer | BD Biosciences | 644832 | |
| FACSDiva 6.1.3 | BD Biosciences | 643629 | Flow Cytometer Acquisition Software |
| FlowJo 10.2 | Treestar Inc. | Flow Cytometry Data Analysis Software | |
| Anti-CXCR3 antibody | BD Horizon | 565223 | |
| Anti-CCR6 antibody | BD Horizon | 563923 | |
| Anti-CXCR5 antibody | BD Horizon | 562747 | |
| Anti-CD4 antibody | BD Horizon | 564419 | |
| Anti-PD-1 antibody | BD Pharmingen | 557946 | |
| Anti-CD45RA antibody | BD Pharmingen | 560674 | |
| Viability Marker | ThermoFisher Scientific | L34973 |
References
- Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M. Follicular Helper T Cells. Annual Review of Immunology. 34 (1), 335-368 (2016).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 Mediates the Development of T Follicular Helper Cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
- Breitfeld, D., et al. Follicular B Helper T Cells Express Cxc Chemokine Receptor 5, Localize to B Cell Follicles, and Support Immunoglobulin Production. The Journal of Experimental Medicine. 192 (11), 1545-1552 (2000).
- Linterman, M. A., et al. Follicular helper T cells are required for systemic autoimmunity. The Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 561-576 (2009).
- Bindea, G., et al. Spatiotemporal Dynamics of Intratumoral Immune Cells Reveal the Immune Landscape in Human Cancer. Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).
- Gu-Trantien, C., et al. CD4+ follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 2873-2892 (2013).
- Amé-Thomas, P., et al. Characterization of intratumoral follicular helper T cells in follicular lymphoma: role in the survival of malignant B cells. Leukemia. 26 (5), 1053-1063 (2012).
- Bossaller, L., et al. ICOS Deficiency Is Associated with a Severe Reduction of CXCR5+CD4 Germinal Center Th Cells. The Journal of Immunology. 177 (7), 4927-4932 (2006).
- Morita, R., et al. Human Blood CXCR5+CD4+ T Cells Are Counterparts of T Follicular Cells and Contain Specific Subsets that Differentially Support Antibody Secretion. Immunity. 34 (1), 108-121 (2011).
- Locci, M., et al. Human circulating PD-1+CXCR3-CXCR5+ memory Tfh cells are highly functional and correlate with broadly neutralizing HIV antibody responses. Immunity. 39 (4), 758-769 (2013).
- He, J., et al. Circulating Precursor CCR7loPD-1hi CXCR5+ CD4+ T Cells Indicate Tfh Cell Activity and Promote Antibody Responses upon Antigen Reexposure. Immunity. 39 (4), 770-781 (2013).
- Schmitt, N., Bentebibel, S. -. E., Ueno, H. Phenotype and functions of memory Tfh cells in human blood. Trends in Immunology. 35 (9), 436-442 (2014).
- Simpson, N., et al. Expansion of circulating T cells resembling follicular helper T cells is a fixed phenotype that identifies a subset of severe systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism. 62 (1), 234-244 (2010).
- Wang, J., et al. High frequencies of activated B cells and T follicular helper cells are correlated with disease activity in patients with new-onset rheumatoid arthritis. Clinical and Experimental Immunology. 174 (2), 212-220 (2013).
- Ueno, H. Human Circulating T Follicular Helper Cell Subsets in Health and Disease. Journal of Clinical Immunology. 36, 34-39 (2016).
- Maecker Holden, T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Jia, Y., et al. Impaired Function of CD4+ T Follicular Helper (Tfh) Cells Associated with Hepatocellular Carcinoma Progression. PLOS ONE. 10 (2), 0117458 (2015).
- Byford, E. T., Carr, M., Ladikou, E., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Circulating Tfh1 (cTfh1) cell numbers and PD1 expression are elevated in low-grade B-cell non-Hodgkin’s lymphoma and cTfh gene expression is perturbed in marginal zone lymphoma. PLOS ONE. 13 (1), 0190468 (2018).
- Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. Journal of Experimental Medicine. 204 (8), 1849-1861 (2007).
- Duan, Z., et al. Phenotype and function of CXCR5+CD45RA-CD4+ T cells were altered in HBV-related hepatocellular carcinoma and elevated serum CXCL13 predicted better prognosis. Oncotarget. 6 (42), 44239-44253 (2015).
- Zhang, X., et al. Circulating CXCR5+CD4+helper T cells in systemic lupus erythematosus patients share phenotypic properties with germinal center follicular helper T cells and promote antibody production. Lupus. 24 (9), 909-917 (2015).
- Sage, P. T., Francisco, L. M., Carman, C. V., Sharpe, A. H. The receptor PD-1 controls follicular regulatory T cells in the lymph nodes and blood. Nature Immunology. 14 (2), 152-161 (2013).
- Sage, P. T., Alvarez, D., Godec, J., von Andrian, U. H., Sharpe, A. H. Circulating T follicular regulatory and helper cells have memory-like properties. The Journal of Clinical Investigation. 124 (12), 5191-5204 (2014).
- Sage, P. T., Tan, C. L., Freeman, G. J., Haigis, M., Sharpe, A. H. Defective TFH Cell Function and Increased TFR Cells Contribute to Defective Antibody Production in Aging. Cell Reports. 12 (2), 163-171 (2015).
- Yu, N., et al. CD4+CD25+CD127low/- T Cells: A More Specific Treg Population in Human Peripheral Blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1780 (2012).
