Isolering av CD4+ T-celler och analys av cirkulerande T-follikulär Helper (cTfh) Cell Subsets från perifert blod använder 6-färg flöda flödescytometri

Summary

Här, ett protokoll för isolering och karakterisering av CD4⁺ T-cell delmängder från perifert blod beskrivs. Renat CD4⁺ T-celler analyseras av flödescytometri att bestämma andelen T-follikulär helper cell delmängder.

Abstract

Avvikande T-follikulär helper (Tfh) cellsaktivitet detekteras i autoimmuna tillstånd och deras närvaro är associerade med kliniska resultat när den lymfkörtel närmiljön i B-cells non-Hodgkins lymfom är analyserat. Delmängder av cirkulerande T-follikulär hjälpare celler (cTfh), den cirkulerande minne facket Tfh celler i blodet, är också oroade i sjukdom och därför representerar potentiella nya Prediktiva biomarkörer. Perifert blod-baserad testning är fördelaktigt eftersom det är relativt icke-invasiv och tillåter enkel seriell övervakning. Den här artikeln beskrivs en metod för att isolera CD4⁺ T-celler från humanblod, och vidare analys av flödescytometri att räkna upp cTfh celler och proportionerna av deras olika undergrupper (cTfhPD-1^{-/ +/ hi}, cTfh1, 2, 17 och cTfh1/17). Nivån på dessa grupper jämfördes sedan mellan friska försökspersoner och patienter med lymfom. Vi hittade att metoden var tillräckligt robust för att få tillförlitliga resultat från rutinmässigt insamlade patientmaterial. Den teknik som vi beskriver för analys kan enkelt anpassas till cell sortering och nedströms tillämpningar såsom RT-PCR.

Introduction

T-follikulär hjälpare celler (Tfh) är en CD4⁺ T-cell delmängd som kännetecknades inledningsvis i lymfvävnad¹. Dessa celler uttrycker PD-1 och CXCR5 yta receptorer, utsöndrar IL-21 och IL-4 och Visa nukleära uttryck av Transkriptionfaktorn, BCL-6^2,3. Som namnet antyder, de finns i stilbildande centrum och är en förutsättning för hög affinitet antikropp produktion¹.

Dysregulated Tfh Svaren har varit inblandade i sjukdomspatogenes, framför allt autoimmun sjukdom, där de främjar utbyggnaden av autoreaktiva B celler⁴. De spelar också en roll i den tumör mikromiljö både solid^5,6 och lymfoida cancerformer⁷. Omvänt, genetiska defekter yta proteiner viktiga för Tfh fungera såsom inducerbara T-cell costimulator (ICOS) resultatet i humant immunbristvirus syndrom⁸. CD4⁺ CXCR5⁺ celler i perifert blod betecknas cirkulerande T-follikulär hjälpare celler (cTfh) och tros vara minne facket Tfh celler i vävnader⁹. Syftet med den metod som beskrivs här är analysen av cTfh grupper efter CD4⁺ cell isolering från perifert blodprover.

Flera cTfh undergrupper har definierats och effektivitet som de ger B-cell hjälp skiljer sig från en delmängd till en annan^9,10,11,12. De relativa proportionerna av dessa grupper är förändrade på ett antal sjukdomar, mest framträdande autoimmun sjukdom där det är nästan alltid en relativ ökning i mer funktionell PD-1^{+/ Hej} eller cTfh2 eller cTfh17 grupper i jämförelse med mindre funktionella PD-1^– eller cTfh1 delmängder¹². Omfattningen av dessa förändringar ofta förknippar med kliniska parametrar inklusive sjukdom aktivitet och autoantikroppar titrar, indikerar en potentiell roll av cTfh delmängd distribution som en prognostisk biomarkörer i sjukdomen, vilket kan återspegla aktiviteten av Tfh i lymfvävnad^9,12,13,14. Dessutom att ta blodprov från deltagarna är snabb, säker och godtagbar, och så tillåter seriell övervakning för analys av sjukdomsprogression eller behandlingssvaret.

Användningen av isolerade CD4⁺ T-celler över traditionella perifera mononukleära (PBMNC) cellsuspensioner möjliggör högre genomströmning flöde flödescytometri experiment genom att minska den tid som krävs för att förvärva ett betydande antal cTfh celler för analys. Detta är särskilt användbart när sortering celler från sällsynta cTfh undergrupper med hjälp av flöde aktiverad cell sortering (FACS). För att underlätta effektiviteten, dessa suspensioner kan förvaras i fryst tillstånd för att aktivera ”dosering” av prover som skall användas i flödet flödescytometri experimentet. Vid provtagning, CD4⁺ renhet inte minskade frysförvaring.

Medan olika laboratorier används olika markörer för att kategorisera cTfh celler i de tidiga stadierna av sin upptäckt, metoden presenteras här använder sig av ett enhetligt system av två grupper av cellytan markörer som föreslagits av Schmidt et al.^{12, 15} till möjliggöra samtidiga identifiering av cTfh och deras nio erkända undertabeller i en enda flödescytometri experimentera.

Som enda cell yta markörer används, cellerna kräver inte fixering eller permeabilisering, och således kan förbli levande för nedströms funktionella studier. Detta kan underlättas genom cell sortering med FACS med samma antikropp panel. Denna panel kan utvidgas för att omfatta andra markörer, möjliggör begränsningarna av den flödescytometer används.

Analysen av flerfärgade flöde flödescytometri experiment kan vara utmanande natur subjektiv pågrund av gating på 2-dimensionella dot tomter, särskilt när cellpopulationer inte har en tydlig bi-modal fördelning i markör fluorescens, som är den fall för cTfh celler och deras undergrupper. Därför är det absolut nödvändigt att inrätta effektiva kontroller för att minska artefakter att möjliggöra bättre upplösning av populationer och ange gating strategier tryggt. Som sådan, antikropp panel design och uppsättning av grundläggande kontroller för en flödescytometri experimentera, dvs använda ersättning och FMO kontroller beskrivs i steg 3.4.2 och 3.4.3,respectively.

Alla cTfh celler definieras som CD4⁺ CXCR5⁺ CD45RA^–. Nivån på uttryck för den karakteristiska Tfh aktivering markören PD-1 kan sedan bestämmas att identifiera delmängder av PD-1^–, PD-1⁺ eller PD-1^Hej cTfh celler. Sedan använda en kombination av chemokine receptorerna CXCR3 och CCR6, som uttrycks differentially av traditionella Th1, 2 eller 17 celler, cTfh kan karakteriseras som cTfh1, 2 eller 17-liknande av en profil av CXCR3⁺ CCR6^–, CXCR3^– CCR6^– , och CXCR3^– CCR6⁺, respektive.

Panelen antikropp används av vårt laboratorium visas i tabell 1. Användaren kan behöva anpassa sin fluorophore urval för att redogöra för laser och ljus-filterkonfiguration tillgänglig på deras lokala flödescytometer.

Följande överväganden påverkar valet av fluorophores. Använd ljusa fluorophores där så är möjligt. I synnerhet använda den ljusaste tillgängliga fluorophores på dämpad (mindre starkt uttryckt) markörer. Dimmer markörer inkludera PD-1, CXCR3 och CCR6, och i mindre utsträckning, CXCR5. Vi särskilt utnyttjat de nyare BB, BV och BUV fluorophores som ger utmärkt ljusstyrka och därmed aktivera lättare upplösning av distinkta populationer av celler.

Spridda fluorophore markeringen över utsläpp spektra så mycket som möjligt för att minimera spektrala överlappning och därmed ersättning krävs. En gratis, online-verktyg som kan användas för att hjälpa till att utforma en flöde flödescytometri panel kan hittas här: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. För att spara utrymme på emissionsspektrum, vi anställt en ”dump-kanal” genom att använda ett livskraft färgämne med emissionsvåglängden som överlappar med det av APC-H7 (konjugerat till CD45RA) för att aktivera den upptäckt och uteslutning av båda döda eller CD45RA⁺ med en enda detektor.

Här presenteras ett protokoll för isolering av perifert blod CD4⁺ T-celler och deras efterföljande analys av flödescytometri att bestämma proportionerna av de olika och nyligen beskriven cirkulerande delmängder.

Protocol

Blodprov erhölls från normala individer (NS) (n = 12) samt patienter med marginell zone lymfom (MZL) (n = 7) och andra typer av B-cells non-Hodgkins lymfom (BNHL) (6 FL patienter, 2 lymfoplasmacytiskt lymfom patienter och 1 låggradig B-cell Non-Hodgkins lymfom inte annat anges patient). Patienterna rekryterades från hematologi klinikerna på Leicester Royal Infirmary efter att ha gett informerat, skriftliga medgivande, med etiskt godkännande för alla studier. Etiskt godkännande erhölls av Leicestershire, Northamp…

Representative Results

Höga CD4+ renhet uppnås med hjälp av CD4+ isolering protokoll, som var pålitliga över alla blodprov testas av oss (menar: 96,6%, SD: 2,38, n = 31) (figur 3). Identifiering av cTfh (CD4+ CXCR5+ celler) i ett representativt normala ämne presenteras (figur 4A). Andel av totala cTfh celler inom CD4+</su…

Discussion

Detta protokoll utgör ett enkelt och effektivt sätt att analysera perifert blod cTfh celler, möjliggör upptäckt av alla relevanta grupper identifieras i litteraturen hittills. Blodprov kan enkelt och effektivt sätt erhållas som en del av standard poliklinisk kliniker och seriell prover kan samlas parallellt med kliniska data. Detta gör i sin tur prospektiva studier utvärdera cTfh delmängder som biomarkörer för sjukdomsprogression eller svar på behandling. Dessa studier skulle vara särskilt motiverat vid sju…

Materials

RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL TECHNOLOGIES	15062
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare Life Sciences	17144003
BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3	BD Horizon	565223
BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9	BD Horizon	563923
BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2	BD Horizon	562747
BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone  RPA-T4	BD Horizon	564419
PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4	BD Pharmingen	557946
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone  HI100	BD Pharmingen	560674
LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	ThermoFisher Scientific	L34973
Brilliant Stain Buffer	BD Horizon	563794
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD CompBead	552843
FACS Aria II Flow Cytometer	BD Biosciences	644832
FACSDiva 6.1.3	BD Biosciences	643629	Flow Cytometer Acquisition Software
FlowJo 10.2	Treestar Inc.		Flow Cytometry Data Analysis Software
Anti-CXCR3 antibody	BD Horizon	565223
Anti-CCR6 antibody	BD Horizon	563923
Anti-CXCR5 antibody	BD Horizon	562747
Anti-CD4 antibody	BD Horizon	564419
Anti-PD-1 antibody	BD Pharmingen	557946
Anti-CD45RA antibody	BD Pharmingen	560674
Viability Marker	ThermoFisher Scientific	L34973