रिवर्स प्रतिलेखन-पाश-मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन (आरटी-दीपक) Zika वायरस और मूत्र, सीरम में गृह व्यवस्था जीन के लिए परख, और मच्छर के नमूने
Summary
इस प्रोटोकॉल एक कुशल और कम लागत विधि मानव मूत्र और सीरम नमूनों में या Zika वायरस या नियंत्रण लक्ष्य का पता लगाने के लिए रिवर्स प्रतिलेखन पाश-मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन (आरटी-चिराग) द्वारा प्रदान करता है । इस विधि आरएनए अलगाव की आवश्यकता नहीं है और 30 मिनट के भीतर किया जा सकता है ।
Abstract
Zika वायरस (ZIKV) के साथ संक्रमण वयस्कों में स्पर्शोन्मुख किया जा सकता है, हालांकि, गर्भावस्था के दौरान संक्रमण गर्भपात और गंभीर स्नायविक जन्म दोष के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य को जल्दी से दोनों मानव और मच्छर के नमूनों में ZIKV का पता लगाने के लिए है । ZIKV डिटेक्शन के लिए वर्तमान स्वर्ण मानक मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर (qRT-पीसीआर); रिवर्स प्रतिलेखन पाश-मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन (आरटी-लैंप) महंगे उपकरणों के लिए आवश्यकता के बिना एक अधिक कुशल और कम लागत के परीक्षण के लिए अनुमति दे सकता है. इस अध्ययन में, आरटी-दीपक पहले नमूना से आरएनए अलग बिना 30 मिनट के भीतर विभिन्न जैविक नमूनों में ZIKV का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस तकनीक ZIKV संक्रमित रोगी मूत्र और सीरम, और संक्रमित मच्छर के नमूनों का उपयोग कर प्रदर्शन किया है । 18S राइबोसोमल ribonucleic एसिड और actin क्रमशः मानव और मच्छर के नमूनों में नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है ।
Introduction
२०१५ में, Zika वायरस (ZIKV) चिंता का एक संक्रामक रोग के रूप में प्रमुख वैश्विक ध्यान प्राप्त किया है क्योंकि गर्भावस्था के दौरान संक्रमण गर्भपात, मृतशिशु, microcephaly सहित गंभीर स्नायविक जंम दोष, साथ ही साथ अंय जंमजात से जुड़ा हुआ था जन्म दोष1. दुर्लभ मामलों में, ZIKV Guillain-Barré सिंड्रोम के साथ जुड़ा हुआ है । ZIKV मुख्यतः एडीज मच्छरों द्वारा फैलता है; हालांकि, यह भी यौन संपर्क1के माध्यम से फैलता जा सकता है । यह देखते हुए कि ZIKV के साथ संक्रमण ज्यादातर लोगों में स्पर्शोन्मुख या हल्के फ्लू जैसे लक्षण है कि अंय arborviruses1के संक्रमण के लक्षणों के साथ ओवरलैप के साथ प्रस्तुत करता है, वहां तेजी से और लागत प्रभावी का पता लगाने के लिए बेहतर तरीकों के लिए एक की जरूरत थी ZIKV दोनों लोगों के साथ ही स्थानीय मच्छर आबादी स्क्रीन करने के लिए ।
मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर (qRT-पीसीआर) ZIKV का पता लगाने के लिए एक विश्वसनीय परख है; हालांकि, इस तकनीक महंगा विशेष उपकरण की आवश्यकता है, प्रशिक्षित कर्मियों, और आरएनए अलगाव ब्याज के नमूने से । रिवर्स प्रतिलेखन पाश-मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन (आर टी-लैंप) एक कदम न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन विधि पीसीआर प्रौद्योगिकी पर आधारित है कि केवल एक गर्मी कतरा के साथ एक thermophilic डीएनए पोलीमरेज़ के उपयोग के कारण तापमान की आवश्यकता है विस्थापन गुण । यह एक thermocycler के लिए जरूरत को दरकिनार और परख पूरा करने के लिए आवश्यक समय की लंबाई कम हो जाती है । RT-लैंप के अतिरिक्त लाभ अपने उच्च विशिष्टता और संवेदनशीलता, पीएच स्तर और तापमान की एक सीमा पर मजबूती, और कई पीसीआर अवरोधकों2के लिए प्रतिरोध शामिल हैं । यह एक अपेक्षाकृत कम लागत और एजेंट कमरे के तापमान पर स्थिर हैं । इन विशेषताओं को देखते हुए, आरटी-दीपक एक प्रयोगशाला में या क्षेत्र में तैनात किया जा सकता है । जैसे, दीपक प्रतिक्रियाओं रोगजनकों और संक्रमण के अंय प्रकार के3,4,5की एक सीमा का पता लगाने के लिए विकसित किया गया है । rt-लैंप प्रोटोकॉल का लक्ष्य इस पत्र में वर्णित है कि मानव सीरम और मूत्र के नमूनों में आरएनए अलगाव के साथ-साथ 30 मिनट के भीतर एक भी संक्रमित मच्छर rt-लैंप के माध्यम से ZIKV का पता लगाने के लिए है । इस विधि qRT-पीसीआर की जगह के रूप में यह एक संवेदनशील, तेजी से नैदानिक उपकरण है कि जल्दी से काम करता है और प्रयोगशाला के बाहर सेटिंग्स में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पत्र में वर्णित ZIKV आरटी-लैंप परख दोनों मानव और मच्छर के नमूने का उपयोग कर काम करता है6। पता लगाने की सीमा लगभग 1 जीनोम समतुल्य6, जो एक रोगसूचक ZIKV संक्रमित रोगी के ठेठ वायरल लोड के बाद से ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम मॉरीन और रोनाल्ड हिर्श परिवार परोपकारी योगदान और क्षेत्र के तंत्रिका विज्ञान संस्थान, सेंट मैरी मिशिगन के द्वारा समर्थित किया गया था । funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी । हम भी Dr. Bernadette Zwaans और एलिय्याह वार्ड पांडुलिपि के उनके महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए धंयवाद ।
Materials
| Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537S | |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380S | |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372S | |
| MgSO4 | New England Biolabs | B1003S | |
| 100mM dATP Solution | New England Biolabs | N0440S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dCTP Solution | New England Biolabs | N0441S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dTTP Solution | New England Biolabs | N0443S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dGTP Solution | New England Biolabs | N0442S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dUTP Solution | Thermo Fisher Scientific | R0133 | |
| SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S7563 | |
| Nancy-520 | Sigma Aldrich | 01494 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10-068-013 | |
| Zika Postive Control | Robert Koch Institute, Germany | N/A | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1600 | |
| BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 10816015 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom Oligo | |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9938 | |
| Urine Preservative | Norgen Biotek | 18126 | |
| ZIKV PCR Standard | Robert Koch Institute | N/A | Vero E6 cell supernatants |
| DENV2 New Guinea C Control | Connecticut Agricultural Experiment Station | N/A |
References
- Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).
- Francois, P., et al. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).
- Gandasegui, J., et al. The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963 (2015).
- Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens. The Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Lamb, L. E., et al. Rapid Detection of Zika Virus in Urine Samples and Infected Mosquitos by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification. Scientific Reports. 8 (1), 3803 (2018).
- Faye, O., et al. One-step RT-PCR for detection of Zika virus. Journal of Clinical Virology. 43 (1), 96-101 (2008).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).
- Poole, C. B., Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C., Carlow, C. K. Diagnosis of brugian filariasis by loop-mediated isothermal amplification. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 6 (12), 1948 (2012).
- Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification. Biotechniques. 53 (2), 81-89 (2012).
- Chan, K., et al. Rapid, Affordable and Portable Medium-Throughput Molecular Device for Zika Virus. Scientific Reports. 6, 38223 (2016).
- Lee, D., et al. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88 (24), 12272-12278 (2016).
- Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
- Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BioMed Central Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
- Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
- Priye, A., et al. A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses. Scientific Reports. 7, 44778 (2017).
