Обратный Assay транскрипции петля опосредованной изотермической амплификация (RT-лампа) для Зика вирус и уборки генов в моче, сыворотки и пробы москитная
Summary
Этот протокол обеспечивает эффективный и недорогой способ обнаружить вирус Зика или контролировать цели в образцах мочи и сыворотки или комаров, обратная транскрипция цикла опосредованной изотермической амплификация (RT-лампа). Этот метод не требует РНК изоляции и может быть сделано в течение 30 мин.
Abstract
Заражение вирусом Зика (ZIKV) может быть бессимптомным у взрослых, однако, инфекции во время беременности может привести к выкидышу и тяжелых неврологических врожденных дефектов. Цель настоящего Протокола заключается в быстро обнаружить ZIKV в образцах человека и комаров. Текущий золотой стандарт для обнаружения ZIKV является количественная обратная транскрипция ПЦР (qRT ПЦР); Обратная транскрипция цикла опосредованной изотермической амплификация (RT-лампа) может позволить для более эффективных и недорогостоящих тестирования без необходимости дорогостоящего оборудования. В этом исследовании RT-лампа используется для обнаружения ZIKV в различных биологических образцов в течение 30 мин, без первой изолировать РНК из образца. Этот метод показан с помощью ZIKV инфицированных пациентов мочи и сыворотки и инфицированных комаров образцы. 18s рибосомных рибонуклеиновой кислоты и актина используются в качестве элементов в образцах человека и комаров, соответственно.
Introduction
В 2015 году Зика вирус (ZIKV) получил видные глобального внимания как инфекционное заболевание озабоченность, поскольку инфекции во время беременности был связан с выкидыш, мертворождение, тяжелые неврологические врожденных дефектов, включая микроцефалия, а также другие врожденные врожденные дефекты1. В редких случаях ZIKV был связан с синдром Гийена-Барре. ZIKV преимущественно передается комарами Aedes ; Однако он также может распространяться через половой контакт1. Учитывая, что инфекции с ZIKV протекает бессимптомно у большинства людей или подарки с мягким гриппоподобные симптомы, которые совпадают с симптомами инфекции других arborviruses1, существует необходимость совершенствования методов для быстрого и экономически обнаружения ZIKV на экран как людей, так и местных комаров населения.
Количественная обратная транскрипция ПЦР (qRT ПЦР) является надежным методом для обнаружения ZIKV; Однако этот метод требует дорогостоящее специализированное оборудование, квалифицированного персонала и изоляции РНК из образца интерес. Обратная транскрипция цикла опосредованной изотермической амплификация (RT-лампа) является одношаговый метод амплификации нуклеиновых кислот, основанный на технологии PCR, которая требует только одной температуры инкубации за счет использовании теплолюбивых ДНК-полимеразы с нити Перемещение свойств. Это обходит необходимость Термоциклер и уменьшает продолжительность времени, необходимого для завершения анализа. Дополнительные преимущества RT-Лампа высокая специфичность и чувствительность, надежность в диапазоне рН и температуры и сопротивление многих ПЦР ингибиторы2. Он имеет сравнительно низкую стоимость и реагенты стабильны при комнатной температуре. Учитывая эти характеристики, RT-лампа может быть развернут в лаборатории или в поле. Таким образом лампа реакции были разработаны для обнаружить широкий спектр патогенов и других видов инфекции3,4,5. Цель протокола RT-лампа, описанных в данном документе является обнаружить ZIKV без изоляции РНК в человеческой сыворотки и мочи образцов, а также как единый инфицированных комаров в течение 30 мин через RT-лампа. Этот метод может использоваться для замены qRT-PCR как это чувствительной, быстрое диагностический инструмент, который работает быстро и в настройках вне лаборатории.
Protocol
Representative Results
Discussion
Пробирная ZIKV RT-лампа, описанные в этой бумаге работ с использованием как человека, так и комаров образцы6. Предел обнаружения был примерно 1 генома эквивалент6, которое должно быть достаточно, поскольку типичная вирусная нагрузка симптоматическим ZIKV инфицирова…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Морин и Рональд Хирш семейный благотворительный вклад и области нейронаук институт, Святой Марии штата Мичиган. Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи. Мы также благодарим д-р Бернадетт Zwaans и Илия Уорд за их критического обзора рукописи.
Materials
| Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537S | |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380S | |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372S | |
| MgSO4 | New England Biolabs | B1003S | |
| 100mM dATP Solution | New England Biolabs | N0440S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dCTP Solution | New England Biolabs | N0441S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dTTP Solution | New England Biolabs | N0443S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dGTP Solution | New England Biolabs | N0442S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dUTP Solution | Thermo Fisher Scientific | R0133 | |
| SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S7563 | |
| Nancy-520 | Sigma Aldrich | 01494 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10-068-013 | |
| Zika Postive Control | Robert Koch Institute, Germany | N/A | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1600 | |
| BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 10816015 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom Oligo | |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9938 | |
| Urine Preservative | Norgen Biotek | 18126 | |
| ZIKV PCR Standard | Robert Koch Institute | N/A | Vero E6 cell supernatants |
| DENV2 New Guinea C Control | Connecticut Agricultural Experiment Station | N/A |
References
- Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).
- Francois, P., et al. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).
- Gandasegui, J., et al. The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963 (2015).
- Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens. The Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Lamb, L. E., et al. Rapid Detection of Zika Virus in Urine Samples and Infected Mosquitos by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification. Scientific Reports. 8 (1), 3803 (2018).
- Faye, O., et al. One-step RT-PCR for detection of Zika virus. Journal of Clinical Virology. 43 (1), 96-101 (2008).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).
- Poole, C. B., Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C., Carlow, C. K. Diagnosis of brugian filariasis by loop-mediated isothermal amplification. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 6 (12), 1948 (2012).
- Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification. Biotechniques. 53 (2), 81-89 (2012).
- Chan, K., et al. Rapid, Affordable and Portable Medium-Throughput Molecular Device for Zika Virus. Scientific Reports. 6, 38223 (2016).
- Lee, D., et al. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88 (24), 12272-12278 (2016).
- Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
- Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BioMed Central Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
- Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
- Priye, A., et al. A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses. Scientific Reports. 7, 44778 (2017).
