Revertir el ensayo de amplificación isotérmica mediada por el lazo de transcripción (RT-LAMP) para el Virus Zika y Housekeeping Genes en muestras de mosquitos, suero y orina
Summary
Este protocolo proporciona un método eficiente y de bajo costo para detectar virus Zika o controlar objetivos en muestras de suero y orina humanas o en mosquitos por amplificación isotérmica mediada lazo de transcripción inversa (RT-LAMP). Este método no requiere aislamiento de RNA y se puede hacer dentro de 30 minutos.
Abstract
Infección con el virus Zika (ZIKV) puede ser asintomática en adultos, sin embargo, la infección durante el embarazo puede causar aborto espontáneo y defectos congénitos neurológicos graves. El objetivo de este protocolo es detectar rápidamente ZIKV en muestras de humanos y mosquito. El actual estándar de oro para la detección de ZIKV es cuantitativa transcripción reversa PCR (qRT-PCR); amplificación isotérmica mediada lazo de transcripción inversa (RT-LAMP) puede permitir una prueba más eficiente y de bajo costo sin necesidad de equipo costoso. En este estudio, RT-lámpara se utiliza para la detección de ZIKV en diversas muestras biológicas dentro de 30 minutos, sin primero aislar el RNA de la muestra. Esta técnica se demostró usando ZIKV infectados en suero y orina de pacientes e infectados muestras de mosquitos. Ácido ribonucleico ribosomal de 18S y actina se utilizan como controles en muestras de humanos y mosquito, respectivamente.
Introduction
En 2015, Zika virus (ZIKV) ganó atención mundial prominente como una enfermedad infecciosa de preocupación porque la infección durante el embarazo era ligada a aborto espontáneo, mortinato, graves defectos congénitos neurológicos incluyendo microcefalia, así como otros congénita defectos de nacimiento1. En casos raros, ZIKV se ha asociado con el síndrome de Guillain-Barré. ZIKV es principalmente transmitida por los mosquitos Aedes ; sin embargo, también se puede propagar a través del contacto sexual1. Dado que la infección con ZIKV es asintomática en la mayoría de la gente o presenta con suaves gripe-como síntomas que se solapan con los síntomas de la infección de otros arborviruses1, hubo una necesidad de mejorar los métodos para la detección rápida y rentable de ZIKV para personas, así como las poblaciones de mosquitos locales.
Cuantitativa transcripción reversa PCR (qRT-PCR) es un ensayo confiable para ZIKV; sin embargo, esta técnica requiere costosos equipos especializados, personal capacitado y aislamiento de RNA de la muestra de interés. Amplificación isotérmica loop-mediated de reversa de la transcripción (RT-LAMP) es un método de amplificación de ácido nucleico un solo paso basado en la tecnología PCR que sólo requiere una temperatura de incubación debido al uso de una polimerasa de la DNA termófila con filamento características de la dislocación. Esto evita la necesidad de un termociclador y disminuye la cantidad de tiempo necesario para completar el ensayo. Ventajas adicionales de RT-LAMP incluyen su alta especificidad y sensibilidad, robustez en una gama de niveles de pH y temperatura y resistencia a muchos de los inhibidores de la PCR2. Tiene un costo relativamente bajo y los reactivos son estables a temperatura ambiente. Dadas estas características, lámpara de RT se puede implementar en un laboratorio o en el campo. Así, las reacciones de la lámpara se han desarrollado para detectar una gama de agentes patógenos y otros tipos de infección3,4,5. El protocolo de RT-LAMP descrito en este documento pretende detectar ZIKV sin aislamiento de RNA en suero y orina muestras humanas así como en un solo mosquito infectado dentro de 30 minutos a través de RT-LAMP. Este método puede utilizarse para reemplazar la qRT-PCR es una herramienta de diagnóstico sensible y rápida que funciona rápidamente y en ambientes fuera del laboratorio.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ensayo de ZIKV RT-LAMP descrito en este papel los trabajos utilizando muestras de humanos y mosquitos6. El límite de detección fue de aproximadamente 1 genoma equivalente6, que debería ser suficiente ya que la carga viral típica de un paciente sintomático ZIKV infectado es de 103 PFU/mL6 107. Además, este método puede detectar ZIKV en muestras sin primer RNA aislamiento y sin amplificación del virus en cu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la contribución filantrópica familia Maureen y Ronald Hirsch y campo Instituto de Neurociencias, Santa María de Michigan. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito. También agradecemos a Dr. Bernadette Zwaans y Elijah Ward por su revisión crítica del manuscrito.
Materials
| Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537S | |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380S | |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372S | |
| MgSO4 | New England Biolabs | B1003S | |
| 100mM dATP Solution | New England Biolabs | N0440S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dCTP Solution | New England Biolabs | N0441S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dTTP Solution | New England Biolabs | N0443S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dGTP Solution | New England Biolabs | N0442S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dUTP Solution | Thermo Fisher Scientific | R0133 | |
| SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S7563 | |
| Nancy-520 | Sigma Aldrich | 01494 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10-068-013 | |
| Zika Postive Control | Robert Koch Institute, Germany | N/A | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1600 | |
| BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 10816015 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom Oligo | |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9938 | |
| Urine Preservative | Norgen Biotek | 18126 | |
| ZIKV PCR Standard | Robert Koch Institute | N/A | Vero E6 cell supernatants |
| DENV2 New Guinea C Control | Connecticut Agricultural Experiment Station | N/A |
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