Omvendt transkripsjon-Loop-mediert isotermiske forsterkning (RT-lampe) analysen for Zika Virus og Housekeeping gener i urin, Serum og mygg prøver
Summary
Denne protokollen gir en effektiv og rimelig metode for å oppdage Zika virus eller kontrollere mål i prøver fra mennesker urin og serum eller mygg av omvendt transkripsjon loop-mediert isotermiske forsterkning (RT-lampe). Denne metoden krever ikke RNA isolasjon og kan gjøres innen 30 min.
Abstract
Zika viruset (ZIKV) kan være asymptomatisk i voksne, men smitte under svangerskapet kan føre til spontanabort og alvorlig nevrologisk fødselsskader. Målet med denne protokollen er å raskt oppdage ZIKV i både menneskelige og mygg. Gjeldende gullstandarden for ZIKV påvisning er kvantitative omvendt transkripsjon PCR (qRT-PCR); omvendt transkripsjon loop-mediert isotermiske forsterkning (RT-lampe) tillate en mer effektiv og rimelig testing uten behov for dyrt utstyr. I denne studien er RT-lampe brukt til ZIKV gjenkjenning i ulike biologiske prøver innen 30 min, uten første isolere RNA fra utvalget. Denne teknikken er demonstrert bruker ZIKV infiserte pasient urin og serum og infisert mygg prøver. 18s ribosomal ribonukleinsyre og utgangen blir brukt som kontroller i menneskelige og mygg prøver, henholdsvis.
Introduction
I 2015 fikk Zika virus (ZIKV) fremtredende global oppmerksomhet som en smittsom sykdom bekymring fordi smitte under svangerskapet var knyttet til spontanabort, dødfødsel, alvorlig nevrologisk fødselsskader inkludert microcephaly, samt andre medfødt fødselsskader1. I sjeldne tilfeller har ZIKV vært forbundet med Guillain-Barrés syndrom. ZIKV overføres primært av Aedes mygg; men kan det også spres gjennom seksuell kontakt1. Gitt at infeksjonen med ZIKV er asymptomatisk i fleste eller presenterer med mild influensalignende symptomer som overlapper med symptomer på infeksjon av andre arborviruses1, var det behov for bedre metoder for rask og kostnadseffektiv påvisning av ZIKV til skjermen både personer samt lokale mygg populasjoner.
Kvantitativ omvendt transkripsjon PCR (qRT-PCR) er en pålitelig analysen til ZIKV oppdagelse. men krever denne teknikken dyre spesialisert utstyr og opplært personale RNA isolasjon fra utvalget av interesse. Omvendt transkripsjon loop-mediert isotermiske forsterkning (RT-lampe) er en ettrinns nukleinsyre forsterkning metode basert på PCR teknologi som bare krever en inkubasjon temperatur skyldes bruk av en varmekjære DNA polymerase med tråd Forskyvning egenskaper. Dette omgår behovet for en thermocycler og reduserer tiden som kreves for å fullføre analysen. Ekstra fordeler av RT-lampe inkluderer dens høy spesifisitet og følsomhet, robusthet på et spekter av pH nivåer og temperaturer og motstand mot mange PCR hemmere2. Den har en relativt lav kostnad og reagenser er stabile ved romtemperatur. Gitt disse egenskapene, kan RT-lampe distribueres i et laboratorium eller i feltet. Som sådan, er lampe reaksjoner utviklet for å oppdage en rekke patogener og andre typer infeksjon3,4,5. Målet med RT-lampe protokollen beskrevet i denne hvitboken er å oppdage ZIKV uten RNA isolasjon i serum og urin prøver fra mennesker så vel som en enkelt infiserte mygg innen 30 min gjennom RT-lampe. Denne metoden kan brukes til å erstatte qRT PCR som det er en følsom, rask diagnostiske verktøy som fungerer raskt og i innstillinger utenfor laboratoriet.
Protocol
Representative Results
Discussion
ZIKV RT-lampe analysen beskrevet i dette papir fungerer med både menneskelig og mygg prøver6. Grensen for deteksjon var ca 1 genomet tilsvarende6, som bør være tilstrekkelig, siden den typiske viral belastningen for en symptomatisk ZIKV infiserte pasient er 103 106 PFU/mL7. I tillegg finner denne metoden ZIKV i prøver uten første skille RNA og uten virus forsterkning i cellekultur. Dette reduserer betydelig ti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Maureen og Ronald Hirsch familie filantropiske bidrag og feltet Neurosciences Institute, St. Marys i Michigan. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet. Vi takker også Dr. Bernadette Zwaans og Elijah Ward for deres kritisk gjennomgang av manuskriptet.
Materials
| Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537S | |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380S | |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372S | |
| MgSO4 | New England Biolabs | B1003S | |
| 100mM dATP Solution | New England Biolabs | N0440S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dCTP Solution | New England Biolabs | N0441S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dTTP Solution | New England Biolabs | N0443S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dGTP Solution | New England Biolabs | N0442S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dUTP Solution | Thermo Fisher Scientific | R0133 | |
| SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S7563 | |
| Nancy-520 | Sigma Aldrich | 01494 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10-068-013 | |
| Zika Postive Control | Robert Koch Institute, Germany | N/A | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1600 | |
| BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 10816015 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom Oligo | |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9938 | |
| Urine Preservative | Norgen Biotek | 18126 | |
| ZIKV PCR Standard | Robert Koch Institute | N/A | Vero E6 cell supernatants |
| DENV2 New Guinea C Control | Connecticut Agricultural Experiment Station | N/A |
References
- Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).
- Francois, P., et al. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).
- Gandasegui, J., et al. The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963 (2015).
- Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens. The Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Lamb, L. E., et al. Rapid Detection of Zika Virus in Urine Samples and Infected Mosquitos by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification. Scientific Reports. 8 (1), 3803 (2018).
- Faye, O., et al. One-step RT-PCR for detection of Zika virus. Journal of Clinical Virology. 43 (1), 96-101 (2008).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).
- Poole, C. B., Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C., Carlow, C. K. Diagnosis of brugian filariasis by loop-mediated isothermal amplification. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 6 (12), 1948 (2012).
- Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification. Biotechniques. 53 (2), 81-89 (2012).
- Chan, K., et al. Rapid, Affordable and Portable Medium-Throughput Molecular Device for Zika Virus. Scientific Reports. 6, 38223 (2016).
- Lee, D., et al. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88 (24), 12272-12278 (2016).
- Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
- Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BioMed Central Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
- Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
- Priye, A., et al. A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses. Scientific Reports. 7, 44778 (2017).
