Omvänd Transkription-Loop-medierad isotermiska amplifiering (RT-lampa) analys för Zika Virus och städning gener i urin, Serum och Mosquito Samples
Summary
Detta protokoll ger en effektiv och billig metod för att upptäcka zikavirus eller styra mål i mänsklig urin och serum prover eller myggor genom omvänd Transkription loop-medierad isotermiska amplifiering (RT-lampa). Denna metod kräver inte RNA isolering och kan göras inom 30 min.
Abstract
Infektion med zikaviruset (ZIKV) kan vara asymtomatisk hos vuxna, men infektion under graviditet kan leda till missfall och allvarliga neurologiska missbildningar. Målet med detta protokoll är att snabbt upptäcka ZIKV i både mänskliga och mygga prover. Den nuvarande guldmyntfoten för ZIKV upptäckt är kvantitativa omvänd Transkription PCR (qRT-PCR); omvänd Transkription loop-medierad isotermiska amplifiering (RT-lampa) kan möjliggöra en mer effektiv och kostnadseffektiv testning utan behovet av dyrbar utrustning. I denna studie används RT-lampa för ZIKV upptäckt i olika biologiska prover inom 30 min, utan första isolera RNA från provet. Denna teknik demonstreras med ZIKV infekterad patient urin och serum, och infekterad mygga prover. 18s ribosomal ribonukleinsyra och aktin används som kontroller i mänskliga och mygga prover, respektive.
Introduction
Under 2015 fick zikavirus (ZIKV) framträdande global uppmärksamhet som en infektionssjukdom i oro eftersom infektion under graviditet länkades till missfall, dödfödsel, allvarliga neurologiska missbildningar inklusive mikrocefali, liksom andra medfödda fosterskador1. I sällsynta fall har ZIKV associerats med Guillain-Barrés syndrom. ZIKV överförs huvudsakligen via Aedes myggor; Det kan dock också spridas genom sexuell kontakt1. Med tanke på att infektionen med ZIKV är asymtomatiska i de flesta eller presenterar med milda influensaliknande symtom som överlappar med symtom på infektion i andra arborviruses1, fanns det ett behov av förbättrade metoder för snabb och kostnadseffektiv påvisande av ZIKV till skärmen personer såväl som lokala mygga populationer.
Kvantitativa omvänd Transkription PCR (qRT-PCR) är en pålitlig analys för ZIKV upptäckt; Denna teknik kräver dock dyr specialutrustning, utbildad personal och RNA isolering från provet av intresse. Omvänd Transkription loop-medierad isotermiska amplifiering (RT-lampa) är en one-step nukleinsyra förstärkning metod baserad på PCR-teknik som endast kräver en inkubation temperatur på grund av användning av en termofila DNA-polymeras med strand deplacement egenskaper. Detta kringgår behovet av en termocykler och minskar tiden som krävs för att slutföra analysen. Ytterligare fördelar med RT-lampa inkluderar dess hög specificitet och känslighet, robusthet vid en rad pH-nivåer och temperaturer, och resistens mot många PCR-hämmare2. Den har en relativt låg kostnad och reagenser är stabila i rumstemperatur. Med tanke på dessa egenskaper, kan RT-lampa distribueras i ett laboratorium eller i fält. Som sådan, har lampa reaktioner utvecklats för att upptäcka ett utbud av patogener och andra typer av infektion3,4,5. Målet med det RT-lampa-protokollet som beskrivs i detta dokument är att upptäcka ZIKV utan RNA isolering i humant serum och urin prover samt som i en enda infekterad mygga inom 30 min genom RT-lampa. Denna metod kan användas för att ersätta qRT-PCR eftersom det är en känslig, snabba diagnostiska verktyg som fungerar snabbt och i inställningar utanför laboratoriet.
Protocol
Representative Results
Discussion
ZIKV RT-lampa analysen beskrivs i detta papper fungerar med både mänskliga och mygga prover6. Detektionsgränsen var cirka 1 genome motsvarande6, som bör vara tillräcklig eftersom den typiska virusmängden av en symtomatisk ZIKV infekterad patient är 103 till 106 PFU/mL7. Denna metod kan dessutom upptäcka ZIKV i prover utan första isolera RNA och utan virus amplifiering i cellkultur. Detta minskar avsevärt de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av Maureen och Ronald Hirsch familjen filantropiska bidrag och fältet neurovetenskap Institute, St Marys Michigan. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller beredning av manuskriptet. Vi tackar också Dr Bernadette Zwaans och Elijah Ward för kritisk granskning av manuskriptet.
Materials
| Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537S | |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380S | |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372S | |
| MgSO4 | New England Biolabs | B1003S | |
| 100mM dATP Solution | New England Biolabs | N0440S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dCTP Solution | New England Biolabs | N0441S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dTTP Solution | New England Biolabs | N0443S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dGTP Solution | New England Biolabs | N0442S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dUTP Solution | Thermo Fisher Scientific | R0133 | |
| SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S7563 | |
| Nancy-520 | Sigma Aldrich | 01494 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10-068-013 | |
| Zika Postive Control | Robert Koch Institute, Germany | N/A | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1600 | |
| BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 10816015 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom Oligo | |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9938 | |
| Urine Preservative | Norgen Biotek | 18126 | |
| ZIKV PCR Standard | Robert Koch Institute | N/A | Vero E6 cell supernatants |
| DENV2 New Guinea C Control | Connecticut Agricultural Experiment Station | N/A |
References
- Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).
- Francois, P., et al. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).
- Gandasegui, J., et al. The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963 (2015).
- Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens. The Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Lamb, L. E., et al. Rapid Detection of Zika Virus in Urine Samples and Infected Mosquitos by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification. Scientific Reports. 8 (1), 3803 (2018).
- Faye, O., et al. One-step RT-PCR for detection of Zika virus. Journal of Clinical Virology. 43 (1), 96-101 (2008).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).
- Poole, C. B., Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C., Carlow, C. K. Diagnosis of brugian filariasis by loop-mediated isothermal amplification. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 6 (12), 1948 (2012).
- Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification. Biotechniques. 53 (2), 81-89 (2012).
- Chan, K., et al. Rapid, Affordable and Portable Medium-Throughput Molecular Device for Zika Virus. Scientific Reports. 6, 38223 (2016).
- Lee, D., et al. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88 (24), 12272-12278 (2016).
- Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
- Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BioMed Central Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
- Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
- Priye, A., et al. A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses. Scientific Reports. 7, 44778 (2017).
