Analisi delle anomalie indotta da β-amiloide sulla struttura di coagulo di fibrina di spettroscopia e microscopia elettronica a scansione
Summary
Presentato qui sono due metodi che possono essere utilizzati singolarmente o in combinazione per analizzare l’effetto di beta-amiloide sulla struttura del coagulo di fibrina. È incluso un protocollo per creazione di coagulo di fibrina in vitro , seguita da coagulo torbidità e microscopia elettronica di esame metodi.
Abstract
Questo articolo presenta metodi per la generazione in vitro coaguli di fibrina e analizzando l’effetto di proteina beta-amiloide (Aβ) sulla struttura e la formazione del coagulo mediante spettrometria e microscopia elettronica (SEM). Aβ, che forma aggregati amiloidi neurotossici nel morbo di Alzheimer (annuncio), ha dimostrato di interagire con il fibrinogeno. Questa interazione di Aβ-fibrinogeno rende il coagulo di fibrina strutturalmente anormale e resistente alla fibrinolisi. Indotta da Aβ anomalie nella coagulazione di fibrina possono anche contribuire a cerebrovascolari aspetti della patologia AD come microinfarti, infiammazione, come pure, Angiopatia amiloide cerebrale (CAA). Dato il ruolo potenzialmente critico dei deficit neurovascolari in patologia di annuncio, lo sviluppo di composti che possono inibire o ridurre l’interazione di Aβ-fibrinogeno ha valore terapeutico promettente. Metodi in vitro dai quali fibrina formazione del coagulo può essere facilmente e sistematicamente valutata sono strumenti potenzialmente utili per lo sviluppo di composti terapeutici. Presentato qui è un protocollo ottimizzato per la generazione in vitro di coagulo di fibrina, nonché l’analisi dell’effetto di inibitori di interazione di Aβ e Aβ-fibrinogeno. Il dosaggio di torbidità di coagulo è rapida, altamente riproducibile e può essere utilizzato per verificare più condizioni contemporaneamente, consentendo per lo screening di un gran numero di inibitori di Aβ-fibrinogeno. Hit composti da questo screening possono essere ulteriormente valutati per la loro capacità di migliorare le anomalie strutturali Aβ-indotta dell’architettura del coagulo di fibrina utilizzando SEM L’efficacia di questi protocolli ottimizzati è dimostrata qui utilizzando TDI-2760, un inibitore di interazione di Aβ-fibrinogeno recentemente identificato.
Introduction
Morbo di Alzheimer (annuncio), una malattia neurodegenerativa che porta al declino cognitivo nei pazienti anziani, prevalentemente nasce dall’espressione anormale di beta-amiloide (Aβ), aggregazione e alterata clearance conseguente neurotossicità1, 2. nonostante l’associazione ben caratterizzato tra Aβ aggregati e AD3, i precisi meccanismi che sono alla base della patologia di malattia non sono ben compreso4. La prova aumentante suggerisce che i deficit neurovascolari svolgono un ruolo nella progressione e nella severità di annuncio5, come Aβ interagisce direttamente con i componenti del sistema circolatorio6. Aβ ha un’interazione ad alta affinità con fibrinogeno7,8, che si localizza anche depositi Aβ in entrambi i pazienti dell’annuncio e del mouse modelli9,10,11. Inoltre, l’interazione di Aβ-fibrinogeno induce la formazione del coagulo di fibrina anormale e struttura, nonché resistenza alla fibrinolisi9,12. Una possibilità terapeutica nel trattamento dell’annuncio, è alleviare i deficit circolatori inibendo l’interazione tra Aβ e fibrinogeno13,14. Abbiamo, pertanto, identificato parecchi piccoli composti inibendo l’interazione di Aβ-fibrinogeno mediante screening su vasta scala e chimica farmaceutica approcci13,14. Per testare l’efficacia degli inibitori di interazione di Aβ-fibrinogeno, abbiamo ottimizzato i due metodi per l’analisi di in vitro formazione di coaguli di fibrina: clot dosaggio di torbidità e scansione microscopia elettronica (SEM)14.
Coagulo torbidità analisi è un metodo semplice e rapido per il monitoraggio di formazione del coagulo di fibrina mediante spettroscopia UV-visibile. Come il coagulo di fibrina forme, luce è sempre più sparsi e la torbidità della soluzione aumenta. Al contrario, quando Aβ è presente, la struttura del coagulo di fibrina è alterata, e la torbidità della miscela è ridotta (Figura 1). L’effetto di composti inibitori può essere valutato per il potenziale ripristinare coagulo torbidità da anomalie di Aβ-indotta. Mentre il dosaggio di torbidità consente per l’analisi rapida di più condizioni, fornisce informazioni limitate sul coagulo forma e struttura. SEM, in cui la topografia di oggetti solidi è rivelata dalla sonda dell’elettrone, permette l’analisi dell’architettura 3D del coagulo15,16,17,18 e la valutazione di come la presenza di Aβ e / o inibitorio composti altera quello struttura9,14. Sia spettrometria e SEM sono tecniche di laboratorio classica che sono state utilizzate per vari scopi, ad esempio, spettrofotometria viene utilizzata per il monitoraggio di aggregazione amiloide19,20. Allo stesso modo, SEM è utilizzato anche per analizzare il coagulo di fibrina formata dal plasma del morbo di Alzheimer, di Parkinson e il colpo thromboembolic pazienti21,22,23. I protocolli presentati qui sono ottimizzati per la valutazione della formazione del coagulo di fibrina in modo rapido e riproducibile.
Il seguente protocollo fornisce le istruzioni per la preparazione di un in vitro -coagulo di fibrina sia con che senza Aβ. Inoltre in dettaglio i metodi per analizzare l’effetto di Aβ sulla formazione del coagulo di fibrina e struttura. L’efficacia di questi due metodi per misurare l’inibizione dell’interazione Aβ-fibrinogeno è dimostrata utilizzando TDI-2760, un piccolo composto inibitorio14. Questi metodi, sia individualmente che insieme, consentono analisi rapida e semplice di in vitro formazione di coaguli di fibrina.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi descritti qui consentono di valutare la fibrina coagulo formazione in vitroin modo rapido e riproducibile. Inoltre, la semplicità del sistema rende l’interpretazione di come Aβ influenza la formazione del coagulo di fibrina e la struttura relativamente semplice. Nella pubblicazione precedente di questo laboratorio, è stato dimostrato che queste analisi possono essere utilizzate per testare composti per la loro capacità di inibire le Aβ-fibrinogeno interazione13,<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Autori ringraziano Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso e Michael Foley da Tri-istituzionale Therapeutics Discovery Institute (TDI), New York per la sintesi di inibitori di interazione di Aβ-fibrinogeno e loro preziosi suggerimenti. Autori ringraziano anche membri del lab Strickland per utile discussione. Questo lavoro è stato supportato da NIH grant NS104386, Drug Discovery Foundation il morbo di Alzheimer e fondo di sviluppo terapeutico Robertson per H.A., NIH concedere NS50537, il Tri-istituzionale Therapeutics Discovery Institute, Fondazione di Alzheimer Drug Discovery, Rudin Family Foundation e John A. Herrmann per S.S.
Materials
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets – Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
References
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