البوليمرات المركبة كتلة متوافقة بيولوجيا ً وظيفية من الميثيونين لتسليم الحمض النووي البلازميد المستهدف
Summary
يعرض هذا العمل إعداد البوليمرات المركبة (mBG) القابلة للإلغاء من خلال طريقة نقل سلسلة الإضافة والتجزؤ (RAFT) القابلة للعكس. كما تم التحقيق في قدرة الحمض النووي البلازميد على تعقيد mBG التي تم الحصول عليها وكفاءتها في الانعتراب. طريقة RAFT مفيدة جدا للبوليمرات مونومرات التي تحتوي على مجموعات وظيفية خاصة.
Abstract
عكسها إضافة تجزئة سلسلة نقل (RAFT) البلمرة يدمج مزايا البلمرة الراديكالية والبلمرة الحية. يعرض هذا العمل إعداد البوليمرات المشتركة للكتل المتوافقة بيولوجياً وظيفية من الميثيونين عن طريق بوليمرة RAFT. أولا، N، N–bis(2-هيدروكسي إيثيل) ميثاكريلاميد-ب–N-(3-أمينوبروبيل) ميثاكريلاميد (BNHEMA-ب– APMA، BA) تم تصنيعها عن طريق البلمرة طوف باستخدام 4،4′-azobis (4-حمض السيانوفاليريك) (ACVA) باعتبارها بدء وكيل و4-سيانوبينتانويك حمض ثنائي ثيوبنزوات (CTP) كعامل نقل سلسلة. في وقت لاحق، N،N-bis(2-هيدروكسي إيثيل) ميثاكريلاميد-ب–N-(3-guanidinopropyl) ميثاكريلاميد (ميثيونين المطعمة BNHEMA-ب-GPMA، mBG) تم إعدادها عن طريق تعديل مجموعات الأمين في APMA مع الميثيونين وغوانيدين مجموعات. تم تصنيع ثلاثة أنواع من البوليمرات كتلة، mBG1، mBG2، وmBG3، للمقارنة. وقد استخدم رد فعل النينهيرين لتحديد كمية محتوى APMA; وكان mBG1، mBG2، وmBG3 21٪، 37٪، و 52٪ من APMA، على التوالي. وأظهرت نتائج التصوير اللوني للجل أن البوليمرات المركبة با تمتلك أوزاناجزية تبلغ 200 16 (BA1) و 900 20 (BA2) و 27200 (BA3) غرام/مول. كما تم التحقيق في قدرة الحمض النووي البلازميد (pDNA) على تعقيد ناقلات الجينات البوليمرية التي تم الحصول عليها. وكانت نسب الشحن (N/P) 8 و16 و4 عندما تم تعقيد pDNA تماما مع mBG1، mBG2، mBG3، على التوالي. عندما كانت نسبة N /P من بوليبليكسس mBG/pDNA أعلى من 1، كانت إمكانات زيتا من mBG إيجابية. في نسبة N /P بين 16 و 32، كان متوسط حجم الجسيمات من mBG / pDNA polyplexes بين 100-200 نانومتر. عموما، يوضح هذا العمل بروتوكول بسيط ومريح لتوليف الناقل copolymer كتلة.
Introduction
في السنوات الأخيرة، ظهر العلاج الجيني للتسليم العلاجي للأحماض النووية كأدوية لعلاج جميع أنواع الأمراض1. تطوير الأدوية الجينية بما في ذلك الحمض النووي بلازميد (pDNA) وصغيرة التدخل RNA (siRNA) يعتمد على استقرار وكفاءة نظام تسليم المخدرات (DDS)2. بين جميع DDS، الناقلين البوليمر الموجبة لديها مزايا الاستقرار الجيد، وانخفاض المناعة، وإعداد سهل ةوتعديل، والتي تعطي الناقلين البوليمر الموجبة آفاق تطبيق واسعة 3،4. للتطبيقات العملية في الطب الحيوي، يجب على الباحثين العثور على الناقل البوليمرالموجبة مع كفاءة عالية، وانخفاض السمية، وقدرة استهداف جيدة 5. بين جميع ناقلات البوليمر، كتلة البوليمرات هي واحدة من أنظمة تسليم المخدرات الأكثر استخداما على نطاق واسع. يتم دراسة البوليمرات المشتركة كتلة بشكل مكثف لممتلكاتهم التجميع الذاتي والقدرات لتشكيل micelles، microspheres، والجسيمات النانوية في تسليم المخدرات5. يمكن تصنيع البوليمرات المشتركة كتلة عن طريق البلمرة الحية أو انقر فوق أساليب الكيمياء.
في عام 1956، أثار Szwarc وآخرون موضوع البلمرة الحية، وتعريفه كرد فعل دون ردود فعل كسر سلسلة6،7. ومنذ ذلك الحين، تم تطوير تقنيات متعددة لتجميع البوليمرات باستخدام هذه الطريقة؛ وهكذا، ينظر إلى البلمرة الحية باعتبارها معلما من علم البوليمر8. يمكن تصنيف البلمرة الحية إلى البلمرة الأنيونية الحية، والبلمرة الموجبة الحية، وتعطيل البلمرة الجذرية القابلة للعكس (RDRP)9. البلمرة الأنيونية /الموجبة الحية لها نطاق محدود من التطبيق بسبب ظروف رد الفعل الصارمة10. البلمرة الراديكالية الخاضعة للرقابة / المعيشة (CRP) لديها ظروف رد فعل خفيفة، والتصرف مريحة، وغلة جيدة، وبالتالي كان التركيز البحثي الرئيسي في السنوات الأخيرة11. في CRP، يتم تمرير سلاسل الانتشار النشطة بشكل عكسي إلى سلاسل خاملة للحد من تركيز الجذور الحرة وتجنب التفاعل الثنائي الجزيئي لتكاثر الجذور المتسلسلة. إضافة البلمرة يمكن أن تستمر فقط إذا كانت سلاسل نشر الخاملة غير النشطة هي الرسوم المتحركة عكسها في سلسلة الجذور. باعتبارها واحدة من أكثر الأشكال الواعدة من البلمرة الراديكالية الحية، عكسها إضافة تجزئة سلسلة نقل (طوف) البلمرة هو وسيلة قابلة للتطبيق لإنتاج البوليمرات كتلة مع الوزن الجزيئي الخاضعة للرقابة والهيكل، والوزن الجزيئي الضيق التوزيع، وحمل المجموعات الوظيفية12. المفتاح إلى ناجحة طوف بلمرة التأثير من سلسلة إنتقال عاملات, عادة [ديثيوسترس], أيّ يملك جدّا عال سلسلة إنتقال ثابتة.
في هذه الورقة، تم تصميم طريقة البلمرة RAFT لإعداد BNHEMA-ب-APMA كتلة البوليمر، مع 4،4′-azobis (4-حمض السيانوفاليريك) (ACVA) كعامل بدء و4-سيانوبينتانويك حمض ثنائي ثيوبنزوات (CTP) كعامل نقل سلسلة. وقد استخدمت البلمرة طوف مرتين لإدخال BNHEMA في ناقلات البوليمر الموجبة. وفي وقت لاحق، تم تعديل مجموعات الأمين في سلسلة APMA مع الميثيونين وكاشف غوانيدينيليل 1-أميديينوبيرازول هيدروكلوريد. الاستفادة من الشحنات الإيجابية من الكاشف guanidinylation وميثاكريلاميد هيكل عظمي البوليمر، تم تحسين كفاءة الانتفاء الخلوية من ناقلات البوليمر كتلة تم الحصول عليها.
Protocol
Representative Results
Discussion
قدمت هذه الدراسة سلسلة من BNHEMA-b-APMA كتلة البوليمر الناقلين الجينات الموجبة. تم تصنيع هذه البوليمرات كتلة عن طريق عكسها إضافة تجزئة سلسلة نقل (RAFT) طريقة. تم إدخال الجزء المائي BNHEMA لتحسين الذوبان. تم تعديل مجموعات الميثيونين والغوانيدين لتحسين القدرة المستهدفة وكفاءة الانتفاء5. ز…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا البحث من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (رقم 2016YFC0905900)، المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (الرقم 81801827، 81872365)، برنامج البحوث الأساسية لمقاطعة جيانغسو (مؤسسة العلوم الطبيعية، رقم. BK20181086)، وصندوق البحوث العلمية في مستشفى جيانغسو للسرطان (رقم ZK201605).
Materials
| 1-hydroxybenzotriazole | Macklin Biochemical Co., Ltd,China | H810970 | ≥97.0% |
| 1,4-dioxane | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10008918 | AR |
| 1-amidinopyrazole Hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | A107935 | 98% |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | E106172 | AR |
| 4,4’-azobis(4-cyanovaleric acid) | Aladdin Co., Ltd., China | A106307 | Analytical reagent (AR) |
| 4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic Acid | Aladdin Co., Ltd., China | C132316 | >97%(HPLC) |
| Acetate | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 81014818 | AR |
| Acetone | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10000418 | AR |
| Agarose | Aladdin Co., Ltd., China | A118881 | High resolution |
| Ascorbic acid | Aladdin Co., Ltd., China | A103533 | AR |
| DMSO | Aladdin Co., Ltd., China | D103272 | AR |
| Ethylene glycol | Aladdin Co., Ltd., China | E103319 | AR |
| N-(3-aminopropyl)methacrylamide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | N129096 | ≥98.0%(HPLC) |
| N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide | ZaiQi Bio-Tech Co.,Ltd, China | CF259748 | ≥98.0%(HPLC) |
| Ninhydrin | Aladdin Co., Ltd., China | N105629 | AR |
| PBS buffer | Aladdin Co., Ltd., China | P196986 | pH 7.4 |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | pDNA-EGFP | pDNA-EGFP |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | Pdna | pDNA |
| Sodium carbonate decahydrate | Aladdin Co., Ltd., China | S112589 | AR |
| Trimethylamine | Aladdin Co., Ltd., China | T103285 | AR |
References
- Flotte, T. R. Gene and Cell Therapy in 2018: A Look Ahead. Human Gene Therapy. 29, 1-1 (2018).
- Huang, W., et al. Nanomedicine-based combination anticancer therapy between nucleic acids and small-molecular drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 115, 82-97 (2017).
- Wu, Y., et al. Reversing of multidrug resistance breast cancer by co-delivery of P-gp siRNA and doxorubicin via folic acid-modified core-shell nanomicelles. Colloids & Surfaces B Biointerfaces. 138, 60-69 (2016).
- Quader, S., Kataoka, K. Nanomaterial-Enabled Cancer Therapy. Molecular Therapy. 25, 1501-1513 (2017).
- Wu, Y., et al. Multivalent methionine-functionalized biocompatible block copolymers for targeted siRNA delivery and subsequent reversal effect on adriamycin resistance in human breast cancer cell line MCF-7/ADR. Journal of Gene Medicine. 19, e2969 (2017).
- Szwarc, M. ‘Living’ Polymers. Nature. 178, 168-169 (1956).
- Szwarc, M., Rembaum, A. Polymerization of methyl methacrylate initiated by an electron transfer to the monomer. Journal of Polymer Science. 22 (100), 189-191 (1956).
- Mukhopadhyay, R. D., Ajayaghosh, A. Living supramolecular polymerization. Science. 349, 241 (2015).
- Ozkose, U. U., Altinkok, C., Yilmaz, O., Alpturk, O., Tasdelen, M. A. In-situ preparation of poly(2-ethyl-2-oxazoline)/clay nanocomposites via living cationic ring-opening polymerization. European Polymer Journal. 88, 586-593 (2017).
- Wu, W., Wang, W., Li, J. Star polymers: Advances in biomedical applications. Progress in Polymer Science. 46, 55-85 (2015).
- Boyer, C., et al. Copper-Mediated Living Radical Polymerization (Atom Transfer Radical Polymerization and Copper(0) Mediated Polymerization): From Fundamentals to Bioapplications. Chemical Reviews. 116, 1803-1949 (2016).
- Keddie, D. J. A guide to the synthesis of block copolymers using reversible-addition fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization. Chemical Society Reviews. 43, 496-505 (2014).
- Wu, Y., et al. Guanidinylated 3-gluconamidopropyl methacrylamide-s-3-aminopropyl methacrylamide copolymer as siRNA carriers for inhibiting human telomerase reverse transcriptase expression. Drug Delivery. 20, 296-305 (2013).
- Qin, Z., Liu, W., Guo, L., Li, X. Studies on Guanidinated N-3-Aminopropyl Methacrylamide-N-2-Hydroxypropyl Methacrylamide Co-polymers as Gene Delivery Carrier. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 23, 1-4 (2012).
- Friedman, M. Applications of the Ninhydrin Reaction for Analysis of Amino Acids, Peptides, and Proteins to Agricultural and Biomedical Sciences. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52, 385-406 (2004).
- Habuchi, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level. Journal of Visualized Experiments. (115), 1-9 (2016).
- Rao, D. A., Nguyen, D. X., Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Alani, A. W. Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles. Journal of Visualized Experiments. 102, 1-5 (2015).
