Methionine Funcionalizou o bloco biocompatible copolímeros para a entrega alvejada do ADN do plasmid
Summary
Este trabalho apresenta a preparação de copolímeros de blocos biocompatíveis (mBG) funcionalizados com metionina através do método de transferência reversível da cadeia de fragmentação de adição (RAFT). A habilidade complexantes do DNA do plasmídeo do MBG obtido e sua eficiência do transfection foram investigadas igualmente. O método da JANGADA é muito benéfico para os monómeros de polimerização que contêm grupos funcionais especiais.
Abstract
A polimerização reversível da transferência chain da adição-fragmentação (JANGADA) integra as vantagens da polimerização radical e da polimerização viva. Este trabalho apresenta a preparação de copolímeros de bloco biocompatível funcionalizados com metionina via polimerização de JANGADA. Primeiramente, n, n–bis(2-Hydroxyethyl) methacrylamide-b–n-(3-AMINOPROPYL) methacrylamide (bnhema-b-APMA, BA) foi sintetizado através da polimerização da jangada usando 4, 4 ‘-AZOBIS (ácido 4-cyanovaleric) (ACVA) como Agente de iniciação e dithiobenzoate do ácido 4-cyanopentanoic (CTP) como o agente de transferência Chain. Subseqüentemente, n, n-bis(2-Hydroxyethyl) methacrylamide-b–n-(3-guanidinopropyl) methacrylamide (metionina enxertada bnhema-b-gpma, MBG) foi preparada modificando grupos de amina em APMA com metionina e guanidina Grupos. Três tipos de polímeros de bloco, mBG1, mBG2 e mBG3, foram sintetizados para comparação. Uma reação de ninidrina foi usada para quantificar o índice de APMA; mBG1, mBG2 e mBG3 tiveram 21%, 37% e 52% de APMA, respectivamente. Os resultados da cromatografia de permeação de gel (GPC) mostraram que os copolímeros da BA possuem pesos moleculares de 16.200 (BA1), 20900 (BA2) e 27200 (BA3) g/mol. A habilidade complexantes do ADN do plasmídeo (PDNA) dos portadores do gene obtido do copolímero do bloco foi investigada igualmente. Os rácios de carga (N/P) foram 8, 16 e 4 quando o pDNA foi complexado completamente com mBG1, mBG2, mBG3, respectivamente. Quando a relação N/P de poliplexes mBG/pDNA foi superior a 1, o potencial zeta de mBG foi positivo. Em uma relação de N/P entre 16 e 32, o tamanho de partícula médio de maioria de MBG/PDNA era entre 100-200 nanômetro. Globalmente, este trabalho ilustra um protocolo simples e conveniente para a síntese do portador do copolímero do bloco.
Introduction
Nos últimos anos, a terapia gênica surgiu para a entrega terapêutica de ácidos nucleicos como drogas para tratar todos os tipos de doenças1. O desenvolvimento de drogas genéticas, incluindo DNA plasmídeo (pDNA) e RNA interferente pequeno (siRNA), depende da estabilidade e eficiência do sistema de distribuição de fármacos (DDS)2. Entre todos os DDS, os portadores de polímero catiônico têm as vantagens de boa estabilidade, baixa imunogenicidade e preparo e modificação facile, que conferem às transportadoras de polímeros catiônicos amplas perspectivas de aplicação3,4. Para aplicações práticas em biomedicina, os pesquisadores devem encontrar um portador de polímero catiônico com alta eficiência, baixa toxicidade e boa capacidade de segmentação5. Entre todos os portadores de polímero, os copolímeros de blocos são um dos sistemas de entrega de drogas mais amplamente utilizados. Os copolímeros de blocos são intensamente estudados para sua propriedade e habilidades de automontagem para formar micelas, microesferas e nanopartículas na entrega de fármacos5. Os copolímeros do bloco podem ser sintetizados através da polimerização viva ou de métodos da química do clique.
Em 1956, Szwarc et al. elevaram o tema da polimerização viva, definindo-o como uma reação sem reações de quebra de cadeia6,7. Desde então, várias técnicas foram desenvolvidas para sintetizar polímeros utilizando este método; assim, a polimerização viva é vista como um marco da ciência do polímero8. A polimerização viva pode ser classificada na polimerização aniónica viva, na polimerização catiônica viva, e na polimerização radical reversível da desactivação (RDRP)9. As polimerizações ANIÓNICAS/catiônicas vivas têm um âmbito de aplicação limitado devido às suas condições de reacção rigorosas10. A polimerização controlada/viva do radical (CRP) tem condições de reação suaves, disposição conveniente, e bom rendimento e foi assim um foco principal da pesquisa nos últimos anos11. Na PCR, as cadeias de propagação ativas são passivadas reversivelmente em dormentes para reduzir a concentração de radicais livres e evitar a reação bimoleculares de propagação de radicais da cadeia. A polimerização da adição pode continuar somente se as correntes de propagação dormentes inativas são animadas reversivelmente em radicais Chain. Como uma das formas mais promissoras de polimerização radical viva, a polimerização reversível de transferência de cadeia de adição-fragmentação (RAFT) é um método aplicável a polímeros de blocos de produção com peso molecular e estrutura controlados, peso molecular estreito distribuição, e carregando grupos funcionais12. A chave à polimerização bem sucedida da JANGADA é o efeito de agentes de transferência Chain, geralmente dithioesters, que possuem constante de transferência Chain muito elevada.
Neste papel, um método da polimerização da JANGADA foi projetado preparar o polímero do bloco de BNHEMA-b-APMA, tomando 4, 4 ‘-azobis (ácido 4-cyanovaleric) (ACVA) como um agente de início e um dithiobenzoate do ácido 4-cyanopentanoic (CTP) como um agente de transferência Chain A polimerização do RAFT foi usada duas vezes para introduzir o BNHEMA nos portadores do polímero catiônico. Subseqüentemente, os grupos da amina na corrente de APMA foram modificados com metionina e o cloridrato 1-amidinopyrazole do reagente do guanidinylation. Fazendo o uso das cargas positivas do reagente do guanidinylation e da estrutura de esqueleto do polímero do metacrilamida, a eficiência celular da captação dos portadores do polímero do bloco obtido foi melhorada.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudo introduziu uma série de portadores do gene catiônicos do polímero do bloco de bnhema-b-APMA. Estes polímeros do bloco foram sintetizados através do método reversível da transferência chain da adição-fragmentação (JANGADA). O segmento hidrofílico BNHEMA foi introduzido para melhorar a solubilidade. Os grupos de metionina e guanidina foram modificados para melhorar a capacidade alvo e a eficiência de transfecção5. O conteúdo da cadeia de APMA aumentou e a guanidinilaçã…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de pesquisa e desenvolvimento chave nacional da China (no. 2016YFC0905900), Fundação Nacional de ciência natural da China (nos. 81801827, 81872365), programa de pesquisa básica da província de Jiangsu (Fundação de ciências naturais, não. BK20181086), e Jiangsu Cancer hospital fundo de investigação científica (no. ZK201605).
Materials
| 1-hydroxybenzotriazole | Macklin Biochemical Co., Ltd,China | H810970 | ≥97.0% |
| 1,4-dioxane | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10008918 | AR |
| 1-amidinopyrazole Hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | A107935 | 98% |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | E106172 | AR |
| 4,4’-azobis(4-cyanovaleric acid) | Aladdin Co., Ltd., China | A106307 | Analytical reagent (AR) |
| 4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic Acid | Aladdin Co., Ltd., China | C132316 | >97%(HPLC) |
| Acetate | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 81014818 | AR |
| Acetone | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10000418 | AR |
| Agarose | Aladdin Co., Ltd., China | A118881 | High resolution |
| Ascorbic acid | Aladdin Co., Ltd., China | A103533 | AR |
| DMSO | Aladdin Co., Ltd., China | D103272 | AR |
| Ethylene glycol | Aladdin Co., Ltd., China | E103319 | AR |
| N-(3-aminopropyl)methacrylamide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | N129096 | ≥98.0%(HPLC) |
| N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide | ZaiQi Bio-Tech Co.,Ltd, China | CF259748 | ≥98.0%(HPLC) |
| Ninhydrin | Aladdin Co., Ltd., China | N105629 | AR |
| PBS buffer | Aladdin Co., Ltd., China | P196986 | pH 7.4 |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | pDNA-EGFP | pDNA-EGFP |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | Pdna | pDNA |
| Sodium carbonate decahydrate | Aladdin Co., Ltd., China | S112589 | AR |
| Trimethylamine | Aladdin Co., Ltd., China | T103285 | AR |
References
- Flotte, T. R. Gene and Cell Therapy in 2018: A Look Ahead. Human Gene Therapy. 29, 1-1 (2018).
- Huang, W., et al. Nanomedicine-based combination anticancer therapy between nucleic acids and small-molecular drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 115, 82-97 (2017).
- Wu, Y., et al. Reversing of multidrug resistance breast cancer by co-delivery of P-gp siRNA and doxorubicin via folic acid-modified core-shell nanomicelles. Colloids & Surfaces B Biointerfaces. 138, 60-69 (2016).
- Quader, S., Kataoka, K. Nanomaterial-Enabled Cancer Therapy. Molecular Therapy. 25, 1501-1513 (2017).
- Wu, Y., et al. Multivalent methionine-functionalized biocompatible block copolymers for targeted siRNA delivery and subsequent reversal effect on adriamycin resistance in human breast cancer cell line MCF-7/ADR. Journal of Gene Medicine. 19, e2969 (2017).
- Szwarc, M. ‘Living’ Polymers. Nature. 178, 168-169 (1956).
- Szwarc, M., Rembaum, A. Polymerization of methyl methacrylate initiated by an electron transfer to the monomer. Journal of Polymer Science. 22 (100), 189-191 (1956).
- Mukhopadhyay, R. D., Ajayaghosh, A. Living supramolecular polymerization. Science. 349, 241 (2015).
- Ozkose, U. U., Altinkok, C., Yilmaz, O., Alpturk, O., Tasdelen, M. A. In-situ preparation of poly(2-ethyl-2-oxazoline)/clay nanocomposites via living cationic ring-opening polymerization. European Polymer Journal. 88, 586-593 (2017).
- Wu, W., Wang, W., Li, J. Star polymers: Advances in biomedical applications. Progress in Polymer Science. 46, 55-85 (2015).
- Boyer, C., et al. Copper-Mediated Living Radical Polymerization (Atom Transfer Radical Polymerization and Copper(0) Mediated Polymerization): From Fundamentals to Bioapplications. Chemical Reviews. 116, 1803-1949 (2016).
- Keddie, D. J. A guide to the synthesis of block copolymers using reversible-addition fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization. Chemical Society Reviews. 43, 496-505 (2014).
- Wu, Y., et al. Guanidinylated 3-gluconamidopropyl methacrylamide-s-3-aminopropyl methacrylamide copolymer as siRNA carriers for inhibiting human telomerase reverse transcriptase expression. Drug Delivery. 20, 296-305 (2013).
- Qin, Z., Liu, W., Guo, L., Li, X. Studies on Guanidinated N-3-Aminopropyl Methacrylamide-N-2-Hydroxypropyl Methacrylamide Co-polymers as Gene Delivery Carrier. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 23, 1-4 (2012).
- Friedman, M. Applications of the Ninhydrin Reaction for Analysis of Amino Acids, Peptides, and Proteins to Agricultural and Biomedical Sciences. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52, 385-406 (2004).
- Habuchi, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level. Journal of Visualized Experiments. (115), 1-9 (2016).
- Rao, D. A., Nguyen, D. X., Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Alani, A. W. Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles. Journal of Visualized Experiments. 102, 1-5 (2015).
