Methionin Funktionaliserede biokompatible blok copolymere til målrettet plasmid DNA levering
Summary
Dette arbejde præsenterer forberedelsen af methionin funktionaliserede biokompatible blok copolymere (mBG) via den reversible tilsætning-fragmentering kæde overførsel (RAFT) metode. Plasmid-DNA-kompleksdannsevnen for den opnåede MBG og deres transfektering effektivitet blev også undersøgt. FLÅDEN metode er meget gavnlig for polymeriserende monomerer indeholder særlige funktionelle grupper.
Abstract
Reversibel tilsætning-fragmentering kæde overførsel (RAFT) polymerisering integrerer fordelene ved radikal polymerisering og levende polymerisering. Dette arbejde præsenterer forberedelsen af methionin funktionaliserede biokompatible blok copolymere via RAFT polymerisering. For det første blev n, n–bis(2-hydroxyethyl) methacrylamid-b–N-(3-AMINOPROPYL) methacrylamid (BNHEMA-b-APMA, BA) syntetiseret via flåde polymerisering med 4, 4 ‘-azobis (4-cyanovaleric Acid) (acva) som en initierende middel og 4-cyanopentanoinsyre dithiobenzoat (CTP) som kæde overførings middel. Efterfølgende blev n, n-bis(2-hydroxyethyl) methacrylamid-b–N-(3-guanidinopropyl) methacrylamid (METHIONIN-podede bnhema-b-gpma, MBG) fremstillet ved at ændre amingrupper i APMA med methionin og guanidin Grupper. Tre slags blok polymerer, mBG1, mBG2 og mBG3, blev syntetiseret til sammenligning. En ninhydrin-reaktion blev anvendt til at kvantificere APMA-indholdet. mBG1, mBG2 og mBG3 havde henholdsvis 21%, 37% og 52% af APMA. Resultaterne af gel gennemtrængning kromatografi (GPC) viste, at BA-copolymere besidder molekylvægte på 16.200 (BA1), 20900 (BA2) og 27200 (BA3) g/mol. Plasmid DNA (pdna) kompleksdannere evne af de opnåede blok copolymer genbærere blev også undersøgt. Opladnings ratioen (N/P) var 8, 16 og 4, da pDNA blev fuldstændigt pakket med henholdsvis mBG1, mBG2, mBG3. Når N/P forholdet mellem mBG/pDNA polyplexer var højere end 1, Zeta potentialet af mBG var positiv. Ved et N/P-forhold mellem 16 og 32 var den gennemsnitlige partikelstørrelse af mBG/pDNA-polyplexer mellem 100-200 Nm. Samlet set illustrerer dette arbejde en enkel og bekvem protokol til blokken copolymer Carrier syntese.
Introduction
I de seneste år, genterapi er dukket op for den terapeutiske levering af nukleinsyre som lægemidler til behandling af alle former for sygdomme1. Udviklingen af genlæge midler, herunder plasmid-DNA (pDNA) og lille interfererende RNA (siRNA), er afhængig af stabiliteten og effektiviteten af lægemiddel leveringssystemet (DDS)2. Blandt alle DDS, kationiske polymer bærere har fordelene ved god stabilitet, lav immunogenicitet, og facile forberedelse og modifikation, som giver kationiske polymer bærere brede anvendelsesmuligheder3,4. Til praktiske anvendelser inden for biomedicin skal forskerne finde en kationisk polymer bærer med høj effektivitet, lav toksicitet og god målretnings evne5. Blandt alle polymer bærere, blok copolymere er en af de mest udbredte lægemidler levering systemer. Blok copolymere er intensivt undersøgt for deres selvstændige montage ejendom og evner til at danne micelles, mikrokugler, og nanopartikler i lægemiddel levering5. Blok copolymere kan syntetiseres via levende polymerisering eller klik kemi metoder.
I 1956, Szwarc et al. rejste emnet levende polymerisering, definere det som en reaktion uden kædebrydende reaktioner6,7. Siden da, flere teknikker var blevet udviklet til at syntetisere polymerer ved hjælp af denne metode; således, levende polymerisering ses som en milepæl af polymer videnskab8. Levende polymerisering kan klassificeres i levende anioniske polymerisering, levende kationisk polymerisering og reversibel deaktivering af radikal polymerisering (RDRP)9. Levende anioniske/kationiske polymeriseringer har et begrænset anvendelsesområde på grund af deres strenge reaktionsbetingelser10. Kontrolleret/levende radikal polymerisering (CRP) har milde reaktionsbetingelser, bekvem disposition, og godt udbytte og har således været en stor forsknings fokus i de seneste år11. I CRP, aktive formering kæder er reversibelt passiveret til sovende dem til at reducere koncentrationen af frie radikaler og undgå interaktion reaktion af formerings kæden radikaler. Tilsætning polymerisering kan kun fortsætte, hvis de inaktive hvilende formerings kæder er reversibelt animeret i kæde radikaler. Som en af de mest lovende former for levende radikal polymerisering, reversibel tilsætning-fragmentering kæde overførsel (RAFT) polymerisering er en metode, der gælder for udbytte blok polymerer med kontrolleret molekylvægt og struktur, smal molekylvægt distribution, og transporterer funktionelle grupper12. Nøglen til en vellykket flåde polymerisering er effekten af kæde overføringsmidler, normalt dithioesters, som besidder meget høj kæde overførsels konstant.
I dette papir, en flåde polymeriserings metode var designet til at forberede BNHEMA-b-APMA blok polymer, tager 4, 4 ‘-azobis (4-cyanovaleric syre) (acva) som en initierende middel og 4-cyanopentanoic syre dithiobenzoate (CTP) som et kæde overførings middel. RAFT polymerisering blev brugt to gange for at introducere BNHEMA i kationiske polymer bærere. Efterfølgende blev amingrupperne i APMA-kæden modificeret med methionin og guanidinylations reagens 1-amidinopyrazolhydrochlorid. Gøre brugen af de positive afgifter af guanidinylation reagens og methacrylamid polymer skelet struktur, den cellulære optagelse effektivitet af de opnåede blok polymer bærere blev forbedret.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne undersøgelse introducerede en serie af BNHEMA-b-APMA blok polymer kationiske genbærere. Disse blok polymerer blev syntetiseret via den reversible tilsætning-fragmentering kæde Transfer (RAFT) metode. Det hydrofile segment bnhema blev introduceret for at forbedre opløselighed. Methionin og guanidin grupper blev modificeret for at forbedre målevnen og transfektering effektivitet5. APMA-kædens indhold steg, og guanidinylering i mBG copolymer reducerede partikelstørrelsen af mBG/pDNA-pol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af det nationale centrale forsknings-og udviklings program i Kina (no. 2016YFC0905900), National Natural Science Foundation i Kina (NOS. 81801827, 81872365), grundlæggende forskningsprogram af Jiangsu-provinsen (Natural Science Foundation, No. BK20181086), og Jiangsu Cancer Hospital videnskabelig forskning fond (nr. ZK201605).
Materials
| 1-hydroxybenzotriazole | Macklin Biochemical Co., Ltd,China | H810970 | ≥97.0% |
| 1,4-dioxane | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10008918 | AR |
| 1-amidinopyrazole Hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | A107935 | 98% |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | E106172 | AR |
| 4,4’-azobis(4-cyanovaleric acid) | Aladdin Co., Ltd., China | A106307 | Analytical reagent (AR) |
| 4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic Acid | Aladdin Co., Ltd., China | C132316 | >97%(HPLC) |
| Acetate | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 81014818 | AR |
| Acetone | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10000418 | AR |
| Agarose | Aladdin Co., Ltd., China | A118881 | High resolution |
| Ascorbic acid | Aladdin Co., Ltd., China | A103533 | AR |
| DMSO | Aladdin Co., Ltd., China | D103272 | AR |
| Ethylene glycol | Aladdin Co., Ltd., China | E103319 | AR |
| N-(3-aminopropyl)methacrylamide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | N129096 | ≥98.0%(HPLC) |
| N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide | ZaiQi Bio-Tech Co.,Ltd, China | CF259748 | ≥98.0%(HPLC) |
| Ninhydrin | Aladdin Co., Ltd., China | N105629 | AR |
| PBS buffer | Aladdin Co., Ltd., China | P196986 | pH 7.4 |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | pDNA-EGFP | pDNA-EGFP |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | Pdna | pDNA |
| Sodium carbonate decahydrate | Aladdin Co., Ltd., China | S112589 | AR |
| Trimethylamine | Aladdin Co., Ltd., China | T103285 | AR |
References
- Flotte, T. R. Gene and Cell Therapy in 2018: A Look Ahead. Human Gene Therapy. 29, 1-1 (2018).
- Huang, W., et al. Nanomedicine-based combination anticancer therapy between nucleic acids and small-molecular drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 115, 82-97 (2017).
- Wu, Y., et al. Reversing of multidrug resistance breast cancer by co-delivery of P-gp siRNA and doxorubicin via folic acid-modified core-shell nanomicelles. Colloids & Surfaces B Biointerfaces. 138, 60-69 (2016).
- Quader, S., Kataoka, K. Nanomaterial-Enabled Cancer Therapy. Molecular Therapy. 25, 1501-1513 (2017).
- Wu, Y., et al. Multivalent methionine-functionalized biocompatible block copolymers for targeted siRNA delivery and subsequent reversal effect on adriamycin resistance in human breast cancer cell line MCF-7/ADR. Journal of Gene Medicine. 19, e2969 (2017).
- Szwarc, M. ‘Living’ Polymers. Nature. 178, 168-169 (1956).
- Szwarc, M., Rembaum, A. Polymerization of methyl methacrylate initiated by an electron transfer to the monomer. Journal of Polymer Science. 22 (100), 189-191 (1956).
- Mukhopadhyay, R. D., Ajayaghosh, A. Living supramolecular polymerization. Science. 349, 241 (2015).
- Ozkose, U. U., Altinkok, C., Yilmaz, O., Alpturk, O., Tasdelen, M. A. In-situ preparation of poly(2-ethyl-2-oxazoline)/clay nanocomposites via living cationic ring-opening polymerization. European Polymer Journal. 88, 586-593 (2017).
- Wu, W., Wang, W., Li, J. Star polymers: Advances in biomedical applications. Progress in Polymer Science. 46, 55-85 (2015).
- Boyer, C., et al. Copper-Mediated Living Radical Polymerization (Atom Transfer Radical Polymerization and Copper(0) Mediated Polymerization): From Fundamentals to Bioapplications. Chemical Reviews. 116, 1803-1949 (2016).
- Keddie, D. J. A guide to the synthesis of block copolymers using reversible-addition fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization. Chemical Society Reviews. 43, 496-505 (2014).
- Wu, Y., et al. Guanidinylated 3-gluconamidopropyl methacrylamide-s-3-aminopropyl methacrylamide copolymer as siRNA carriers for inhibiting human telomerase reverse transcriptase expression. Drug Delivery. 20, 296-305 (2013).
- Qin, Z., Liu, W., Guo, L., Li, X. Studies on Guanidinated N-3-Aminopropyl Methacrylamide-N-2-Hydroxypropyl Methacrylamide Co-polymers as Gene Delivery Carrier. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 23, 1-4 (2012).
- Friedman, M. Applications of the Ninhydrin Reaction for Analysis of Amino Acids, Peptides, and Proteins to Agricultural and Biomedical Sciences. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52, 385-406 (2004).
- Habuchi, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level. Journal of Visualized Experiments. (115), 1-9 (2016).
- Rao, D. A., Nguyen, D. X., Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Alani, A. W. Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles. Journal of Visualized Experiments. 102, 1-5 (2015).
