التلقائي القائم علي الصورة الكمية من الفخاخ العدلات خارج الخلية باستخدام NETQUANT
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لتوليد الفخاخ العدلات خارج الخلية (الناموسيات) وتشغيل NETQUANT ، وهو خيار البرمجيات التلقائي بالبالكامل للقياس الكمي من الناموسيات في الصور المناعية.
Abstract
الفخاخ خارج الخلية العدلات (الناموسيات) هي علي شبكه الإنترنت مثل الهياكل المضادة للميكروبات التي تتكون من الحمض النووي والحبيبية البروتينات المضادة للميكروبات. المجهر المناعي وطرق التحديد الكمي المستندة إلى الصورة لا تزال أدوات هامه لتكميم الخلايا العدلات تشكيل فخ. ومع ذلك ، هناك قيود رئيسيه علي الأساليب القائمة علي المناعي المتاحة حاليا لقياس الشبكات. الطرق اليدوية للقياس الكمي NET المستندة إلى الصورة غالبا ما تكون ذاتية ، عرضه للخطا ومملة للمستخدمين ، وخاصه المستخدمين غير المتمرسين. كما ان خيارات البرمجيات المتاحة حاليا للقياس الكمي هي اما شبه تلقائية أو تتطلب تدريبا قبل التشغيل. هنا ، ونحن نظهر تنفيذ طريقه القياس التلقائي القائم علي المناعي الصورة لتقييم تشكيل NET تسمي NETQUANT. البرنامج هو سهل الاستخدام ولها واجهه مستخدم رسوميه صديقه للمستخدم (GUI). وهي تعتبر المعلمات ذات الصلة بيولوجيا مثل زيادة في المساحة السطحية والحمض النووي: صافي نسبه البروتين علامة ، وتشوه الذرية لتحديد تشكيل NET. وعلاوة علي ذلك ، تم بناء هذه الاداه باعتبارها التطبيق المتاحة بحريه ، ويسمح للقياس الكمي دقه الخلية الواحدة والتحليل.
Introduction
العدلات هي وسطاء حاسمه من الاستجابات الدفاع المضيف الفطرية ضد مجموعه واسعه من مسببات الامراض الميكروبية1. يقومون بتنفيذ وظائفهم المضادة للميكروبات عن طريق الإفراج عن حبيباتهم التي تحتوي علي مجموعه واسعه من البروتينات المضادة للميكروبات2، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) و هيبوكلويد1، ومن خلال كثرة الكريات3. الاضافه إلى ذلك ، برينجمان وآخرون. 4 وصفت الفخاخ العدلات خارج الخلية (الشباك) كاليه جديده من قبل التي العدلات فخ والقضاء علي مسببات الامراض الغازية. منذ اكتشافها ما يزيد قليلا علي عقد من الزمان4, وقد تورطت الناموسيات في مجموعه واسعه من المعدية5,6 وغير المعدية7 الاعتلالات. تكوين NET هو عمليه نشطه والنتائج في قذف الحمض النووي الكروماتين المغلفة مع الحبيبية المشتقة من البروتينات المضادة للميكروبات8. وتشمل بعض التغييرات الرئيسية في المورفولوجية الخلوية والنووية المرتبطة بالتشكيل الصافي فقدان المورفولوجية النووية ، وتفكيك الكروماتين ، وتعبئة البروتينات الحبيبية من السيتوبلاسما إلى النواة وزيادة في القطر النووي والخلوي8،9.
الشبكة مثل شبك, اي يمكن ظهرت كبنيه منتشرة قليلا كبيره من الخلية أو بما ان بني عده أوقات كبيره من [العدلات] وحيده اعتبرت كمؤشرات من [نيسس]5,10. باستخدام المجهر الفلوري ، يمكن الكشف عن الناموسيات عن طريق التحقق من الحمض النووي مع مسبار الفلورسنت مثل 4 ‘ ، 6-diamidino-2-فينيلانديول (DAPI) وتلطيخ المناعي ضد البروتينات صافيه ملزمه مثل اللدائن المرنة. يحدد القياس الكمي للمناطق المتداخلة من تلطيخ الحمض النووي والبروتينات المربوطة بالناموسيات المساحة الاجماليه تحت الشباك في صوره11.
وهناك عدد من خيارات تحليل الصور المتاحة لأداء القياس الكمي القائم علي الصورة من الشباك11,12. ولكن هذه الخيارات البرمجيات الحالية القيود في عدم ان تكون سهله الاستخدام و/أو مؤتمتة بالبالكامل. في هذه المقالة ، ونحن نظهر تشغيل NETQUANT13، وهو التطبيق المتاحة بحريه التي يمكن ان تؤدي غير متحيزة بالبالكامل المجهرية المناعية صوره المجهر القائم علي الصور NET. التطبيق لديه واجهه رسوميه سهله الاستخدام (GUI) ويمكن اجراء تحليل خليه واحده. البرنامج ثبت قيمه netosis في صوره عن طريق الكشف عن التغييرات المورفولوجية في منطقه الحمض النووي-صافي-ملزمه علامة ، الكروماتين تفكيك المرتبطة تشوه النواة وزيادة في الحمض النووي: صافي-نسبه البروتين. ومعا ، تسمح معايير التعريف المتعددة NET بالتحديد الكمي الصارم لصافي المعلومات عبر عده مجموعات من البيانات بطريقه غير متحيزة.
Protocol
Representative Results
Discussion
التشكيل الصافي هو أضافه حديثه نسبيا إلى المتنوعة العدلات ارمينتماريوم4 وكان هناك طفرة ملحوظة من الفائدة لدراسة اثار الشباك في مجموعه واسعه من مجالات البحث5,7,14,15. اقتناء الصور باستخدام المجهر المناعي والكم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وتم تمويل العمل من قبل مؤسسه كرافورد (TM و PN) ، ومنحه البحوث الحكومية السويدية (PN ، TM) ، ومجلس البحوث السويدي (PN) ومؤسسه غروشنسكي (TM ، PN).
Materials
| BD Vacutainer Heparinised plastic tubes | BD Biosciences | 367885 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 114547 | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine | Gibco | 11835-030 | |
| 50mL conical flasks | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 15mL conical flasks | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 12-well Tissue culture plates | Falcon | 10626491 | |
| #1 Coverslips 10mm | Menzel Glaser | CS10100 | |
| Glass slides | Menzel Glaser | 631-0098 | |
| Primary anti-human elastase | DAKO | DAKO rabbit 1373, contract immunization | |
| Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit | Life technologies | A-11072, A-11070 | |
| PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI | Life technologies | P36930 | Mounting medium |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Nikon Ti-E Epifluorescence microscope | Nikon | ||
| CCD camera | Andor Zyla | ||
| Plan Apochromat 20x, 40x objectives | Nikon | ||
| Windows 10 | Microsoft | Operating system | |
| macOS Sierra 10.12 | Apple | Operating system | |
| MATLAB | Mathworks |
References
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Nordenfelt, P., Tapper, H. Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Sorensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps – the dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
- Yipp, B. G., Kubes, P. NETosis: how vital is it?. Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Mohanty, T., et al. A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa. Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).
- Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Coelho, L. P., et al. Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images. Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).
- Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps. Frontiers in Immunology. 8, 1999 (2017).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Cedervall, J., Olsson, A. K. Immunity Gone Astray – NETs in Cancer. Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).
- Ginley, B. G., et al. Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 17755 (2017).
