NETQUANT Kullanarak Nötrofil Ekstrasellüler Tuzakların Otomatik Görüntü Tabanlı Niceliği
Summary
Burada, nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NETTs) ve işletim NETQUANT, immünororesans görüntüleri NTs quantification için tam otomatik bir yazılım seçeneği oluşturmak için bir protokol salıyoruz.
Abstract
Nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NETs) DNA ve granül türemiş antimikrobiyal proteinlerden oluşan web benzeri antimikrobiyal yapılardır. İmmünofloresan mikroskobu ve görüntü tabanlı nicelikselleştirme yöntemleri nötrofil ekstrasellüler tuzak oluşumunu hesaplamak için önemli araçlar olmaya devam etmektedir. Ancak, şu anda NETs ölçmek için kullanılabilir immünoresans tabanlı yöntemler için önemli sınırlamalar vardır. Görüntü tabanlı NET sayısallaştırmanın manuel yöntemleri genellikle özneldir, hataya yatkındır ve kullanıcılar, özellikle de deneyimsiz kullanıcılar için sıkıcıdır. Ayrıca, sayısallaştırma için mevcut yazılım seçenekleri ya yarı otomatik ya da çalışmadan önce eğitim gerektirir. Burada NETQUANT adı verilen NET oluşumunu değerlendirmek için otomatik immünoresaneses esaslı görüntü ölçme yönteminin uygulanmasını gösteriyoruz. Yazılımın kullanımı kolaydır ve kullanıcı dostu bir grafik kullanıcı arabirimine (GUI) sahiptir. Net oluşumunu tanımlamak için yüzey alanı ve DNA:NET marker protein oranı ve nükleer deformasyon gibi biyolojik olarak ilgili parametreleri dikkate alır. Ayrıca, bu araç serbestçe kullanılabilir bir uygulama olarak inşa edilmiştir ve tek hücreli çözünürlükte niceleme ve analiz sağlar.
Introduction
Nötrofiller mikrobiyal patojenler1geniş bir yelpazede karşı doğuştan gelen konak savunma yanıtları önemli aracılar vardır. Onlar antimikrobiyal proteinler in geniş bir yelpazede içeren granülleri serbest bırakarak antimikrobiyal fonksiyonlarını yürütmek2, reaktif oksijen türleri üreten (ROS) ve hipoklorit1, ve fagositoz yoluyla3. Buna ek olarak, Brinkmann ve ark. 4 nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NETs) tarafından nötrofiller tuzak ve işgalci patojenleri ortadan kaldırmak yeni bir mekanizma olarak tanımlanır. Onların keşfi biraz üzerinde bir on yıl önce4,NETs bulaşıcı5geniş bir yelpazede karıştığı edilmiştir,6 ve bulaşıcı olmayan7 morbiditeler. NET oluşumu aktif bir süreçtir ve granül türetilmiş antimikrobiyal proteinler ile kaplanmış kromatin DNA ekstrüzyon sonuçları8. NET oluşumu ile ilişkili hücresel ve nükleer morfolojiönemli değişikliklerden bazıları nükleer morfoloji kaybı, kromatin dekonsökonsilasyon, çekirdeğin sitoplazma granül proteinlerinin seferberliği ve nükleer ve hücresel çapı bir artış8,9.
Hücreden biraz daha büyük veya tek bir nötrofilden birkaç kat daha büyük yapılar olarak ortaya çıkabilecek web benzeri NET’ler, NETosis5,10′un göstergeleri olarak kabul edilir. Floresan mikroskobu kullanılarak, NET’ler DNA’yı 4′,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) gibi floresan sonda ile probenerek ve nötrofil elastaz gibi NET’e bağlı proteinlere karşı immünfloresans boyama ile tespit edilebilir. DNA ve NET’e bağlı proteinler için örtüşen boyama alanlarının ölçülmesi, bir görüntüdeki NET’lerin altındaki toplam alanı belirler11.
NETs11,12floresan görüntü tabanlı nicelik gerçekleştirmek için görüntü analizi seçenekleri bir dizi kullanılabilir. Ancak bu yazılım seçenekleri, kullanıcı dostu ve/veya tam otomatik olmamak gibi sınırlamalar sunar. Bu makalede, tarafsız tam otomatik immünoreskence mikroskopi görüntü tabanlı NET nicelik gerçekleştirebilen serbestçe kullanılabilen bir uygulama olan NETQUANT13’ünişleyişini gösteriyoruz. Uygulama kullanıcı dostu bir grafik arabirimine (GUI) sahiptir ve tek hücreli analiz gerçekleştirebilir. Yazılım, DNA-NET’e bağlı belirteç, çekirdeğin kromatin dekonsiyomu ile ilişkili deformasyon ve DNA:NET’e bağlı protein oranındaki artışı alandaki morfolojik değişiklikleri algılayarak görüntüdeki NETozu ölçer. Birlikte ele alındığında, birden çok NET tanımı ölçütleri tarafsız bir şekilde çeşitli veri kümeleri arasında sıkı NET nicellik sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
NET oluşumu çeşitli nötrofil armamentarium için nispeten yeni bir ektir4 ve araştırma alanları geniş bir yelpazede NETTs inmasını incelemek için ilgi belirgin bir dalgalanma olmuştur5,7,14,15. İmmünfluoresan mikroskopi ve sonraki görüntü tabanlı nicelik kullanılarak görüntülerin elde edilmesi, NET’leri ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma Crafoord Vakfı (TM ve PN), İsveç Hükümeti Araştırma hibe (PN, TM), İsveç araştırma konseyi (PN) ve Groschinsky Vakfı (TM, PN) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| BD Vacutainer Heparinised plastic tubes | BD Biosciences | 367885 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 114547 | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine | Gibco | 11835-030 | |
| 50mL conical flasks | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 15mL conical flasks | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 12-well Tissue culture plates | Falcon | 10626491 | |
| #1 Coverslips 10mm | Menzel Glaser | CS10100 | |
| Glass slides | Menzel Glaser | 631-0098 | |
| Primary anti-human elastase | DAKO | DAKO rabbit 1373, contract immunization | |
| Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit | Life technologies | A-11072, A-11070 | |
| PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI | Life technologies | P36930 | Mounting medium |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Nikon Ti-E Epifluorescence microscope | Nikon | ||
| CCD camera | Andor Zyla | ||
| Plan Apochromat 20x, 40x objectives | Nikon | ||
| Windows 10 | Microsoft | Operating system | |
| macOS Sierra 10.12 | Apple | Operating system | |
| MATLAB | Mathworks |
References
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Nordenfelt, P., Tapper, H. Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Sorensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps – the dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
- Yipp, B. G., Kubes, P. NETosis: how vital is it?. Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Mohanty, T., et al. A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa. Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).
- Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Coelho, L. P., et al. Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images. Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).
- Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps. Frontiers in Immunology. 8, 1999 (2017).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Cedervall, J., Olsson, A. K. Immunity Gone Astray – NETs in Cancer. Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).
- Ginley, B. G., et al. Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 17755 (2017).
