使用 NETQUANT 对中性粒细胞外陷阱的自动基于图像的定量

Summary

在这里，我们提出了一个协议，用于生成中性粒细胞外陷阱（NETs）和操作NETQUANT，这是一种用于定量免疫荧光图像中的NET的全自动软件选项。

Abstract

嗜中性粒细胞外陷阱（NETs）是由DNA和颗粒衍生抗菌蛋白组成的类似网络的抗菌结构。免疫荧光显微镜和基于图像的定量方法仍然是定量中性粒细胞细胞外陷阱形成的重要工具。然而，目前可用于量化NET的基于荧光的方法存在关键局限性。基于图像的 NET 量化的手动方法通常是主观的，对于用户（尤其是没有经验的用户）来说，容易出错和繁琐。此外，目前可用的量化软件选项要么是半自动的，要么需要在操作前进行培训。在这里，我们演示了基于免疫荧光的自动图像定量方法的实现，以评估NET形成称为NETQUANT。该软件易于使用，具有用户友好的图形用户界面（GUI）。它考虑了与生物学相关的参数，如表面积和DNA：NET标记蛋白比的增加，以及核变形，以定义NET的形成。此外，此工具是作为一个免费的应用程序构建的，并允许单细胞分辨率量化和分析。

Introduction

嗜中性粒细胞是对抗各种微生物病原体的先天宿主防御反应的关键^中介。它们通过释放含有多种抗菌^蛋白2的颗粒、产生活性氧（ROS）和次氯^酸盐1以及通过方噬菌^体3来执行其抗菌功能。此外，布林克曼等人。⁴将嗜中性粒细胞外陷阱 （NETs） 描述为一种新型机制，通过这种机制，嗜中性粒细胞可以捕获和消除入侵的病原体。自从十多年前发现4，NETS就与各种传染性^的5、6和非^传染性7病症有关。NET形成是一个活跃的过程，导致染色质DNA的挤出涂有颗粒衍生抗菌^蛋白8。与NET形成相关的细胞和核形态的一些关键变化包括核形态的丧失、染色质变性、将颗粒蛋白从细胞质调动到细胞核以及增加核和细胞^{直径8、9。}

网络状的NET，可能显示为比细胞稍大的漫射结构或比单个嗜中性粒细胞大好几倍的结构，被认为是NETosis^5，10的指标。使用荧光显微镜，通过检测DNA，如4’，6-二酰胺-2-phenylindole（DAPI），并通过免疫荧光染色对NET结合的蛋白质，如中性粒细胞介酶，可以检测NET。在^图11中，DNA和NET结合蛋白的重叠染色区域的量化决定了NET下的总面积。

有许多图像分析选项可用于执行基于荧光图像^{的NETs11、12}的定量。但是，这些软件选项在用户不友好和/或完全自动化方面存在限制。在本文中，我们演示了NETQUANT¹³的操作，这是一个免费的应用程序，可以执行无偏的全自动免疫荧光显微镜基于NET定量。该应用程序具有用户友好的图形界面 （GUI），可以执行单单元分析。该软件通过检测DNA-NET结合标记区域的形态变化、染色质分离相关细胞核变形和DNA：NET结合蛋白比的增加来量化图像中的NETosis。综合起来，多个 NET 定义标准允许以无偏的方式跨多个数据集进行严格的 NET 量化。

Protocol

隆德大学道德委员会根据《赫尔辛基宣言》（2013/728）批准从健康志愿者中采集静脉血。所有志愿者都提供了书面知情同意。 1. 使用密度-梯度离心分离外周血中性粒细胞的分离 在含有肝素的管中收集人类静脉血，使管达到室温。注意：至少需要健康献血者16 mL的血液才能产生足够大的细胞颗粒。 将血液与盐水中的 2% dextran（0.9% NaCl）混合，在室温下在无菌 5…

Representative Results

5 x 105嗜中性粒细胞/mL 被播种在放置在 12 孔板上的盖玻片上，用 20 nM PMA 刺激或离开未刺激 150 分钟。然后，使用原发兔抗人类中性粒细胞乳酸酶抗体、二级山羊抗兔氟荧光抗体和DAPI（一种带有荧光标签的染色DNA的染料）对样本进行染色（详情见材料表）。然后，使用荧光显微镜和20X（NA = 0.75）目标获取至少5个图像。通过按照<a href="https://nordlab.med.lu.s…

Discussion

NET的形成是一个相对较新的除了不同的中性粒细胞^武器4，并已出现了明显激增的兴趣，研究NET在广泛的研究领域5，7，14，15。使用免疫荧光显微镜和随后基于图像的定量采集图像是一种广泛使用的量化 NET 的方法。这种方法的优点是能够检测在单细胞水平上形成NET的细胞，因此可以?…

Materials

BD Vacutainer Heparinised plastic tubes	BD Biosciences	367885
Lymphoprep	Axis-Shield	114547
RPMI-1640 with L-Glutamine	Gibco	11835-030
50mL conical flasks	Sarstedt	62.547.004
15mL conical flasks	Sarstedt	62.554.002
12-well Tissue culture plates	Falcon	10626491
#1 Coverslips 10mm	Menzel Glaser	CS10100
Glass slides	Menzel Glaser	631-0098
Primary anti-human elastase	DAKO	DAKO rabbit 1373, contract immunization
Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit	Life technologies	A-11072, A-11070
PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI	Life technologies	P36930	Mounting medium
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma-Aldrich	79346
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Nikon Ti-E Epifluorescence microscope	Nikon
CCD camera	Andor Zyla
Plan Apochromat 20x, 40x objectives	Nikon
Windows 10	Microsoft		Operating system
macOS Sierra 10.12	Apple		Operating system
MATLAB	Mathworks