Mechanismen die ten grondslag liggen aan de Gut hormoon afscheiding met behulp van de geïsoleerde geperfundeerd Rat dunne darm

Summary

Hier presenteren we een krachtige en fysiologische model voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de darm hormoon afscheiding en intestinale absorptie — de geïsoleerde geperfundeerd rat dunne darm.

Abstract

De darm is het grootste endocriene orgaan van het lichaam, het produceren van meer dan 15 verschillende peptide-hormonen die de eetlust en voedsel inname, spijsvertering, nutriënten-absorptie en distributie en postprandiale glucose excursies regelen. Inzicht in de moleculaire mechanismen die gut hormoon afscheiding regelen is fundamenteel voor het inzicht en het vertalen van gut hormoon fysiologie. Traditioneel, de mechanismen die ten grondslag liggen aan de darm hormoon afscheiding zijn ofwel studeerde in vivo (in proefdieren of mens) of met behulp van gut hormoon-afscheidende primaire mucosal cel culturen of cellijnen. Hier introduceren we een geïsoleerde geperfundeerd rat dunne darm als een alternatieve methode voor het bestuderen van de darm hormoon afscheiding. De deugden van dit model zijn dat het afhankelijk van de darm intact is, wat betekent dat het grootste deel van de verantwoordelijk voor de afscheiding in in vivo onderzoek, met inbegrip van mucosal polarisatie, paracrine relaties en routes van fysiologisch belangrijke parameters recapituleert perfusie/stimulans blootstelling. Bovendien, en in tegenstelling tot in vivo onderzoek, voorziet de geïsoleerde geperfundeerd rat dunne darm bijna volledige experimentele controle en directe beoordeling van secretie. In tegenstelling tot het in vitro onderzoek is het mogelijk om te studeren zowel de omvang en de dynamiek van secretie en om belangrijke vragen te stellen, zoals wat prikkels veroorzaken de secretie van verschillende hormonen, van welke kant van de darm (luminal of vasculaire) afscheiding is gestimuleerd, en om te analyseren in detail moleculaire sensoren ten grondslag liggen aan de secretoire reactie. Bovendien, is de voorbereiding een krachtig model voor de studie van intestinale absorptie en details met betrekking tot de dynamiek van intestinale absorptie met inbegrip van de verantwoordelijke transporteurs.

Introduction

De darm is het grootste endocriene orgaan van het lichaam, het produceren van meer dan 15 verschillende peptide hormonen die regelen nutriënten-absorptie en nutriënten dispositie, intestinale groei en moduleren eetlust¹. Gut hormonen zijn, dus betrokken bij vele fundamentele fysiologische processen, en het begrip van deze patronen van secretie en de moleculaire details waarmee de secretie van de respectieve hormonen is dus van belang voor onze basic fysiologische begrip en voor het aanpakken van translationeel aspecten van gut hormoon acties; maar hoe kan men het bestuderen van de moleculaire sensing mechanismen ten grondslag liggen aan de darm hormoon afscheiding? In het algemeen, de secretie van het hormoon kan worden bestudeerd in intact organismen (mens of proefdieren), uit geïsoleerde gut preparaten of darm hormoon-afscheidende primaire celculturen of vereeuwigd cel culturen^{2,3, 4 , 5 , 6}. onze voorkeur model is de geïsoleerde geperfundeerd rat dunne darm, die een fysiologisch relevante model waarmee de afscheiding van hormonen van de darm is tot in detail met optimale tijd resolutie (secretie tarieven kunnen worden bepaald met elk gewenst moment worden bestudeerd basis tot de tweede), en de resultaten zijn waarschijnlijk overdraagbaar naar een in vivo situatie⁷. Hier bieden we een gedetailleerd protocol over het uitvoeren van deze procedure, maar eerst zullen we andere methoden voor het bestuderen van de darm hormoon afscheiding, met inbegrip van de voordelen en beperkingen van deze modellen ten opzichte van de geïsoleerde geperfundeerd rat dunne darm.

Als men wenst vast te stellen of een specifieke stof de afscheiding van bepaalde hormonen gut regelt, zijn studies bij de mens het uiteindelijke doel. Dus, als een samengestelde grote gevolgen voor de secretie van één of meerdere gut hormonen in knaagdieren (in vivo of perfusions geeft) of van hormoon afscheidende cellen (cellijnen of primaire cellen), dit effect is alleen relevant voor geneeskunde en menselijke fysiologie als het kan worden bevestigd bij de mens. Echter, er zijn duidelijke grenzen voor het type van studies die bij de mens kunnen worden uitgevoerd, en in vivo onderzoek op proefdieren zijn, daarom vaak de tweede beste optie voor dergelijke studies. Muizen en ratten zijn de meest gebruikte proefdieren vermoedelijk vanwege hun handige formaat, lage kosten en de mogelijkheid om het genetisch veranderen de genen die verdacht worden van betrokkenheid bij de specifieke studie vragen (bijvoorbeeld kloppen uit een bepaalde vervoerder of receptor). In het algemeen, in vivo modellen profiteren van die fysiologisch intact, maar hebben ook verschillende beperkingen. Belangrijker, de geringe omvang van knaagdieren, met name muizen, is een beperkende factor, aangezien de meeste testen voor gut hormoon kwantificering ten minste 20 µL vereist van plasma (en vaak nog veel meer), wat betekent dat ten minste 100 µL bloed moet worden ingetrokken om een duplicaat kwantificering. Daarom is het alleen mogelijk te krijgen zeer weinig monsters overeenkomt met basislijn monsters en één of twee na stimulatie monsters (het volume van de totale bloed in een muis van 20 g is ~1.4 mL). Bijgevolg, potentiële secretoire Reacties (bijvoorbeeld, snel of laat voorkomende reacties) kan daarom worden gemist.

In het model van de perfusie, dit probleem wordt overwonnen, als grote steekproef volumes worden verkregen (debiet: 7,5 mL/min) en de intervallen van de collectie kunnen worden aangepast om ervoor te zorgen dat de snelle en korte durende reacties zijn niet gemist (wij voorbeelden verzamelen om min)⁷ . Een ander probleem met in vivo onderzoeken bij knaagdieren is dat de meeste gut hormonen zelfs meer zijn snel geëlimineerd of gemetaboliseerd dan in mensen^8,9,10, die de latere biochemische analyse kunnen bemoeilijken. Bijvoorbeeld, we toonden dat GLP-1 wordt gemetaboliseerd in muizen in een nog sneller tempo dan bij de mens (1-2 min¹¹is waar T_1/2 ) en, nog belangrijker, waarbij het splijten van GLP-1 bij muizen, naast N-terminale decolleté door dipeptidyl-dipeptidylpeptidase-4 (DPP4) (dat is het grote GLP-1 vernederende enzym bij de mens), verder splijten door het enzym neutrale endopeptidase 24.11¹². Bijgevolg, huidige commerciële testen voor de kwantificering van GLP-1, die ofwel zijn gebaseerd op de intacte isovorm van GLP-1 (7-36amide) of de DPP-4 gekloofd isovorm (9-39amide), enorm onderschatten van GLP-1 secretie in muizen en leiden tot misleidende resultaten ¹². in de dunne darm van geïsoleerde geperfundeerd rat, allermeest naar de stofwisseling van secreted hormonen is uitgeschakeld of aanzienlijk verlaagd, aangezien plasma-gemedieerde afbraak wordt vermeden, en extractie/aantasting van de lever/nier/longen wordt geblokkeerd omdat ( perfusaat wordt verzameld als het verlaat de darm).

Natuurlijk belangrijk inzicht kan worden gegenereerd door het gebruik van genetisch gemodificeerde dieren, bijvoorbeeld, sodium-glucose transporter-1 knock-out muizen¹³, maar een gedetailleerde beoordeling van de moleculaire sensoren die betrokken zijn bij de secretie vaak vereist behandeling van meerdere moleculaire sites, variërend van moleculaire vervoerders tot ionenkanalen en van verschillende G-proteïne-gekoppelde receptoren aan intracellulaire eiwitten. Bijvoorbeeld, we gericht de activiteit van negen verschillende moleculaire sites bij het ontrafelen van de moleculaire sensoren verantwoordelijk voor glucose-gestimuleerd GLP-1 secretie⁷. Een soortgelijk onderzoek zou niet mogelijk in vivo als sommige van de stoffen gebruikt aspecifieke hebben of schadelijke/letale effecten. Bijvoorbeeld, wanneer u de perfused darm, was het mogelijk om het beoordelen van de rol van intra-cellulaire glucose metabolisme voor de secretie van GLP-1 en neurotensin door het blokkeren van ATP vorming met 2-4-dinitrofenol^7,14 , evenals de rol van spanning-gated calcium kanalen voor gal zuur gestimuleerd GLP-1, NT en PYY secretie³. Inderdaad, de zeer giftig natrium kanaal blocker tetrodotoxine kan met succes worden toegepast in de perfusie-studies. Ten slotte, in de perfusie-model het kan worden rechtstreeks beoordeeld waar in de darm een bepaalde stof stimuleert de secretie van een bepaald hormoon, zoals de onderzoeker kan eenvoudig kiezen en bereiden van het gewenste gebied te perfuse, en op hetzelfde moment kunnen worden onderzocht of een stimulus veroorzaakt secretie door activering van moleculaire sensoren van de luminal of vasculaire kant van de darm^3,15,16.

De secretoire mechanismen onderliggende gut hormoon afscheiding kan ook worden bestudeerd door gebruik van gut weefsel stukken (inclusief menselijk weefsel), intestinale culturen van de primaire (meestal van de muizen), vereeuwigd hormoon afscheidende cellijnen (voor muis of menselijke oorsprong) door de darm weefsel in Ussing chambers of door organoids (beide meestal uit muizen)^{2,3,4,5,6,17,18}gemonteerd. Vergeleken met intestinale perfusions, studies over de menselijke darm stukken, primaire celculturen en cellijnen zijn technisch eenvoudiger uit te voeren en een snellere en goedkopere manier van het genereren van gegevens, maar natuurlijk de studie van gut stukken vereist toegang tot vers menselijke darm exemplaren. Echter, in deze modellen de normale cel polarisatie van de darm is inherent verloren, wat betekent dat deze modellen niet worden gebruikt voor het beoordelen van de normale activering van moleculaire sensoren, en absorptie processen ook kunnen niet worden bestudeerd. Bovendien dergelijke studies meestal statische incubations dienst (voor tot verschillende h) die is zeer niet-fysiologische en heeft niets te maken met de cellen normaal secretoire dynamiek, omdat het secreted product wordt niet verwijderd en dus kan feedback invloed op de afscheiding van hormonen. In tegenstelling, in de perfused darm, worden secreted en geabsorbeerd moleculen efficiënt verwijderd door de mucosal microcirculatie zoals ze in vivo zijn, ervoor te zorgen dat de transmucosal verlopen worden gehandhaafd zodat absorptie en secretie tegen een normale prijs optreden kunnen. Bovendien, celculturen kunnen hebben dedifferentiated hun inheemse enteroendocrine cel afkomstig zijn, wat betekent dat ze zijn niet langer de vertegenwoordiger van de oorspronkelijke cellen peptide inhoudelijk en expressie van moleculaire sensoren, hoewel ze nog steeds het desbetreffende hormoon afscheiden. Dit is bijvoorbeeld het geval voor de GLP-1 dat cel lijnen¹⁹.

Het is daarom onze mening dat primaire celculturen of mobiele lijn studies zijn meest geschikt voor screeningonderzoek en voor het uitvoeren van typen experimenten die niet kunnen uitgevoerd in vivo worden of in de geïsoleerde perfused darm. Bijvoorbeeld, een ware kracht van de primaire celculturen en lijn celculturen is dat intra-cellulaire secundaire boodschappers (bv Ca^{2 +}, kamp, NAD(P)H) in real-time kan worden gecontroleerd, en elektrische signalering van het hormoon afscheidende cellen kunnen ^20,21,22onderzocht. Bovendien, kan siRNA knockdown gebeuren, dat is met name handig als specifieke remmers niet beschikbaar^{20,21,22,23,24}. Weefsel van de darm van muizen die zijn gemonteerd in Ussing kamers onlangs is gebruikt voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de gal-zuur gestimuleerd GLP-1 secretie, terwijl intestinale organoids (van muizen) en menselijke darm stukken zijn ook gebruikt voor het bestuderen van de moleculaire details van gut hormoon afscheiding^17,25. Overwegende dat de vroegere uitkeringen worden gepolariseerd² al deze modellen gekenmerkt door statische incubations. Studies over de menselijke darm stukken, echter profiteren van het gebruik van weefsel van menselijke, in plaats van knaagdieren, die belangrijk is aangezien soorten verschil in weefsel expressie van 7TM-receptoren en moleculaire vervoerders kunnen resulteren in verschillende moleculaire sensing routes tussen soorten. In feite, de meeste gegevens in dit veld is gegenereerd door studies over varkens, muizen of ratten, en het blijft ongrijpbaar of deze bevindingen kunnen worden overgedragen op de mens. Het is echter gerust te stellen dat de moleculaire sensing mechanismen die ten grondslag liggen aan de glucose-gestimuleerd GLP-1 secretie lijken vergelijkbaar tussen muis, rat, man, en transcriptomic en peptidomic profilering van muis en mens L-cellen bleek sterk global overeenkomsten tussen de twee soorten^7,18,26,27.

De geïsoleerde geperfundeerd rat dunne darm, maar heeft ook enkele beperkingen die u moeten overwegen. Bovenal is het onmogelijk om te bepalen of een bepaalde secretoire reactie voortvloeit uit directe activering door de teststof voor de gerichte hormoon-producerende cellen of liever gezegd wordt veroorzaakt door een indirect mechanisme. Bijvoorbeeld, KCl verhoogt direct GLP-1 secretie van de perfused darm⁷, maar het blijft onbekend of dit een gevolg van directe depolarisatie van de L-cel of van depolarisatie van neuronen dicht bij de L-cellen of de gevolgen van resultaten tegelijkertijd uitgebracht paracrine stimulatoren/remmers. Gegevens als gevolg van studies met behulp van de perfused darm die gericht zijn op het ophelderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de afscheiding moet daarom altijd worden in context geplaatst met gegevens die zijn verkregen van andere meer specifieke modellen tot het verhogen van de mogelijkheid om vast te stellen causaliteit. Glucose-gestimuleerd GLP-1 secretie van de GLP-1 dat cellijn GLUTag^28,29 en van de primaire muisknop L-cellen is bijvoorbeeld afhankelijk van de activiteit van de vervoerders van de glucose (SGLT1 en GLUT2). Deze vervoerders in de geperfundeerd rat dunne darm blokkeren ook verzwakt secretie²⁰, wat betekent dat het is waarschijnlijk dat glucose-gestimuleerd GLP-1 secretie is grotendeels gemedieerd door directe acties van glucose op de L-cel. Een andere belangrijke beperking van de geïsoleerde perfused darm is dat sommige van de lipiden zijn moeilijk om te studeren als gevolg van hun hydrophobicity. Hoewel het mogelijk is te onderzoeken van de eindproducten van lipide spijsvertering (vetzuren, diacyl glycerols, lysophosphatidylglycerols, enz.) en hoewel de voorbereiding mogelijk opnieuw esterify pak de lipiden tijdens cellularly en misschien ze in chylomicrons, het vervoer van de chylomicrons uit de cellen en hun latere opname door de lacteals van de villi is verstoord, omdat de stroom van lymfe in de geïsoleerde darm kan niet worden beveiligd. Meest waarschijnlijk, daarom, lipide absorptie is stopgezet zodra de geabsorbeerde producten begint te ophopen in de cellen. De cel in vitro-systemen zijn zelfs minder geschikt voor lipide studies wegens hun gebrek aan polarisatie. Uiteraard is deze beperking is alleen relevant voor lipiden die worden geabsorbeerd en vervoerd via de lacteals, overwegende dat die geabsorbeerd via de intestinale bloedvaten dreigen te worden normaal verwerkt.

Protocol

Alle studies werden uitgevoerd met toestemming van de Deense dier experimenten inspectie (2013-15-2934-00833) en de lokale ethisch comité, overeenkomstig de richtsnoeren van de Deense wetgeving inzake dierproeven (1987) en de nationale Instituten voor gezondheid (publicatienummer 85-23). 1. proefdieren Verkrijgen van mannelijke Wistar ratten (250 g), huis 2 per kooi, met ad libitum toegang tot standaard chow en water, en onderhouden in een 12:12 h licht-donker cyclus. Onze dieren f…

Representative Results

De mogelijkheid om te bepalen of een bepaalde stimulus secretie van het hormoon van de darm van belang veroorzaakt, is afhankelijk van een constante basislijn-secretie. Bovendien, indien geen reactie is op de prikkel wordt waargenomen, een robuuste secretoire reactie op de positieve controle moet duidelijk zijn om uit te sluiten dat het gebrek aan respons op de test prikkel niet met een algemeen gebrek aan respons overeenkomt. Figuur 2A en 2B…

Discussion

De geïsoleerde geperfundeerd rat dunne darm is een krachtige onderzoeksinstrument waarmee de dynamiek en de moleculaire mechanismen ten grondslag liggen aan de darm hormoon afscheiding tot in detail worden bestudeerd. De meest kritische stap voor de succesvolle productie van gegevens met dit model is de chirurgische ingreep. Behandeling van de darm zal onvermijdelijk wat schade aan de darm veroorzaken en moet daarom worden beperkt tot een absoluut minimum. De snelheid van werking is zelfs nog belangrijker, sleutel, met …

Materials

Chemicals for perfusion buffer
Bovine serum albumin (BSA)	Merck	1.12018.0500
Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O)	Merck	102382
Dextran 70	Pharmacosmos	40014
Fumaric acid disodium salt (C4H2Na2O4)	Sigma Aldrich	F9642
Glucose (C6H12O6)	Merck	108342
Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4)	Merck	105886
Potasium chloride (KCl)	Merck	104936
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Merck	104873
Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4)	Merck	106619
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Merck
Sodium chloride (NaCl)	Merck	106404
Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O)	Merck	106445
Name	Company	Catalog Number	Comments
Perfusion equitment
Universial perfusion system	Harvard Bioscience, Inc.	732316
BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834	Harvard Bioscience, Inc.
Roller Pump, with four channels	Harvard Bioscience, Inc.	730100
Windkessel	Harvard Bioscience, Inc.	732068
Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz	Harvard Bioscience, Inc.	730125
Operating table, heated on tripod stand, type 873	Harvard Bioscience, Inc.	733776
Cannula with basked, OD= 2.0mm, ID= 1.0mm	Harvard Bioscience, Inc.	733313