Mécanismes sous-jacents Gut sécrétion de l’Hormone à l’aide de l’isolé perfusé intestin grêle de Rat
Summary
Nous présentons ici un modèle puissant et physiologique pour étudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la sécrétion de l’hormone intestinale et l’absorption intestinale, l’intestin grêle de rat isolé et perfusé.
Abstract
L’intestin est le plus grand organe endocrinien du corps, produisant plus de 15 hormones peptidiques différents qui régulent l’appétit et l’alimentation, digestion, absorption des nutriments et distribution et excursions de la glycémie post-prandiale. Comprendre les mécanismes moléculaires qui régulent la sécrétion de l’hormone intestinale est fondamental pour comprendre et traduire gut hormone physiologie. Traditionnellement, les mécanismes qui sous-tendent la sécrétion de l’hormone intestinale sont bien étudiés in vivo (chez les animaux ou les humains) ou l’utilisation primaire de sécrétant des hormones du tube digestif muqueux cultures de cellules ou lignées de cellules. Ici, nous introduisons un intestin grêle de rat perfusée isolé comme une méthode alternative pour l’étude de la sécrétion de l’hormone intestinale. Les vertus de ce modèle sont qu’il repose sur l’intestin intact, ce qui signifie qu’il récapitule la plupart des paramètres physiologiquement importants responsables de la sécrétion des études in vivo, y compris les muqueuse polarisation, relations paracrine et itinéraires de exposition de perfusion/stimulation. En outre et contrairement aux études in vivo, l’intestin grêle de rat perfusée isolé permet un contrôle expérimental presque complet et une évaluation directe de la sécrétion. Contrairement aux études in vitro, il est possible d’étudier l’ampleur et la dynamique de la sécrétion et à poser des questions importantes, telles que quels stimuli provoquent la sécrétion d’hormones différentes gut, de quel côté du tube digestif (luminal ou vasculaire) est la sécrétion Ils sont stimulés et d’analyser dans les capteurs moléculaires de détail qui sous-tendent la réponse sécrétoire. En outre, la préparation est un modèle puissant pour l’étude de l’absorption intestinale et des détails sur la dynamique de l’absorption intestinale, y compris les transporteurs responsables.
Introduction
L’intestin est le plus grand organe endocrinien du corps, produisant plus de 15 hormones peptidiques différents qui régulent l’absorption des nutriments et de disposition des éléments nutritifs, de croissance intestinale et modulent l’appétit1. Hormones du tube digestif sont, par conséquent, impliqués dans de nombreux processus physiologiques fondamentaux, et de comprendre ces schémas de sécrétion et les détails moléculaires qui contrôlent la sécrétion des hormones respectifs est donc importante pour notre physiologiques de base compréhension et pour traiter des aspects translationnelles des actions de l’hormone intestinale ; Mais comment on peut étudier les mécanismes moléculaires de détection qui sous-tendent la sécrétion de l’hormone intestinale ? En général, la sécrétion de l’hormone peut être étudiée dans les organismes intacts (les humains ou les animaux de laboratoire), de préparations d’intestin isolé ou de cultures de cellules primaires de tube digestif sécrétant des hormones ou immortalisé cell cultures2,3, 4 , 5 , 6. notre modèle préféré est l’intestin grêle de rat isolé et perfusé, qui est un modèle physiologiquement pertinent qui permet la sécrétion d’hormones du tube digestif à étudier en détail avec une résolution temporelle optimal (sécrétion taux peuvent être déterminés avec n’importe quel moment base à la seconde), et les résultats sont probables transférable à une situation in vivo7. Ici, nous fournissons un protocole détaillé sur la façon d’effectuer cette procédure, mais tout d’abord nous allons discuter d’autres méthodes pour étudier la sécrétion de l’hormone intestinale, y compris les avantages et les limites de ces modèles par rapport à l’intestin grêle de rat isolé et perfusé.
Si l’on veut établir si un composé spécifique régule la sécrétion de certaines hormones du tube digestif, les études chez l’humain sont le but ultime. Ainsi, si un composé montre des effets considérables sur la sécrétion d’une ou plusieurs hormones intestinale chez les rongeurs (in vivo ou perfusions) ou d’hormones sécrétant des cellules (lignées cellulaires ou cellules primaires), cet effet est uniquement pertinent à la médecine et de physiologie humaine si elle peut être confirmée chez l’homme. Cependant, il y a des limites claires pour le type d’études qui peuvent être effectuées chez l’humain, et des études in vivo sur les animaux de laboratoire sont donc souvent la deuxième-meilleure option pour de telles études. Souris et les rats sont les animaux de laboratoire le plus souvent utilisés sans doute en raison de leur taille pratique, faible coût et la possibilité de modifier génétiquement les gènes soupçonnés d’implication dans les questions de l’étude spécifique (par exemple, frapper hors certains transporteur ou récepteurs). En général, les modèles in vivo gagnerait à être physiologiquement intact, mais aussi présentent plusieurs limites. Surtout, la petite taille des rongeurs, en particulier les souris, est un facteur limitant, comme la plupart dosages pour la quantification d’hormone intestinale nécessitent au moins 20 µL de plasma (et souvent beaucoup plus), ce qui signifie qu’au moins 100 µL de sang doit être retirée pour faire un duplicata quantification. Par conséquent, il n’est possible d’obtenir de très peu d’échantillons correspondant aux échantillons de départ et un ou deux échantillons après stimulation (le volume sanguin total chez une souris de 20 g est ~1.4 mL). Par conséquent, les réponses sécrétrices potentiels (par exemple, rapidement ou réponses tardive survenant) peut donc manquer.
Dans le modèle de la perfusion, ce problème est surmonté, comme échantillon de grand volumes sont obtenues (débit : 7,5 mL/min) et les intervalles de la collection peuvent être ajustés selon les besoins pour s’assurer que les réponses rapides et de courte durée ne sont pas ratés (nous recueillir les échantillons toutes les min)7 . Un autre problème avec études in vivo chez les rongeurs est que la plupart des hormones intestin sont encore plus rapidement éliminé ou métabolisé que chez les humains8,9,10, ce qui peut compliquer l’analyse biochimique qui. Par exemple, nous avons montré que le GLP-1 est métabolisé chez les souris à un rythme encore plus rapide que chez les humains (où T1/2 est 1-2 min11) et, plus important encore, que le clivage du GLP-1 chez les souris implique, outre un clivage N-terminale de dipeptidyl-peptidase-4 (DPP4) (qui est l’enzyme dégradant majeur de GLP-1 chez l’homme), plus le clivage par l’enzyme endopeptidase neutre 24.1112. En conséquence, les tests commerciaux actuellement pour la quantification du GLP-1, qui reposent soit sur l’isoforme intact du GLP-1 (7-36amide) ou l’isoforme de la DPP-4 clivé (9-39amide), largement sous-estiment la sécrétion de GLP-1 chez les souris et entraînent trompeuse des résultats 12. dans l’intestin grêle de rat isolé et perfusé, la plupart du métabolisme des hormones sécrétées est éliminé ou sensiblement réduit, puisque la dégradation induite par le plasma est évitée, et extraction de foie/rein/poumon/dégradation est empêchée (parce que perfusat est perçue comme il laisse le tube digestif).
Bien sûr, un aperçu important peut être généré par l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés, par exemple, sodium-glucose transporteur-1 knockout souris13, mais nécessite une évaluation détaillée des sondes moléculaires impliqués dans la sécrétion souvent examen des sites moléculaires multiples, allant des transporteurs moléculaires de canaux ioniques et des différents récepteurs couplés aux protéines G de protéines intracellulaires. Par exemple, nous avons ciblé l’activité des neuf sites moléculaires différentes lors de démêler les capteurs moléculaires responsables de la sécrétion de GLP-1 stimulée par le glucose7. Une enquête similaire ne serait pas possible in vivo, comme certains des composés utilisés imprécise ou effets nocifs/létaux. Par exemple, lorsque vous utilisez l’intestin perfusé, il a été possible d’évaluer le rôle du métabolisme du glucose intra-cellulaire de la sécrétion de GLP-1 et la neurotensine en bloquant la formation d’ATP avec 2-4-dinitrophénol7,14 , mais aussi le rôle de canaux voltage-dépendants de calcium des acides biliaires stimulent de la sécrétion de GLP-1, NT et PYY3. En effet, la tétrodotoxine de bloqueur de canal sodium hautement toxique peut être appliquée avec succès dans les études de perfusion. Enfin, dans le modèle de perfusion il peut être directement évaluée où dans le tube digestif un certain composé stimule la sécrétion d’une hormone de certains, que l’enquêteur peut simplement choisir et préparer la région souhaitée pour perfuse, et en même temps, elle peut être étudiée Si un stimulus provoque la sécrétion par l’activation des capteurs moléculaires du côté luminal ou vasculaire de l’intestin3,15,16.
Les mécanismes de sécrétion sécrétion intestinale sous-jacente peut également être étudiée par utilisent des morceaux de tissu de tube digestif (y compris les tissus humains), hormone de cultures primaires intestinale (habituellement des souris), immortalisés sécrétant des lignées cellulaires (de souris ou d’origine humaine), de l’intestin tissu monté dans des chambres de Ussing ou en organoïdes (à la fois plus souvent des souris)2,3,4,5,6,17,18. Par rapport aux perfusions intestinales, études sur les pièces de l’intestin humain, cultures de cellules primaires et des lignées cellulaires sont techniquement plus faciles à réaliser et sont un moyen plus rapide et moins coûteux de produire des données, mais bien sûr l’étude des morceaux de tube digestif requiert l’accès à l’intestin humain frais spécimens. Toutefois, dans ces modèles la polarisation normale des cellules de l’intestin est intrinsèquement perdue, ce qui signifie que ces modèles ne peuvent servir à évaluer l’activation normale de sondes moléculaires, et processus d’absorption ne peuvent également être étudiés. En outre, ces études utilisent habituellement des incubations statiques (pour jusqu’à plusieurs h) qui est hautement non physiologiques et n’a rien à voir avec dynamique de sécrétion normale LiPo, parce que le produit sécrété n’est pas supprimé et donc vos commentaires peuvent influencer le sécrétion d’hormones. En revanche, dans l’intestin perfusé, molécules sécrétées et absorbés sont efficacement éliminés par la microcirculation muqueuse de car ils sont in vivo, respecter les gradients transmuqueux donc absorption et sécrétion peuvent se produire à un rythme normal. En outre, cultures de cellules peuvent avoir dedifferentiated de leur origine de cellules entéroendocrines native, ce qui signifie qu’ils ne sont plus représentant des cellules natives en termes de contenu de peptide et l’expression des sondes moléculaires, même si elles peuvent encore sécrètent l’hormone en question. Par exemple, c’est le cas pour le GLP-1 sécrétrices cellules lignes19.
C’est, par conséquent, nous estimons que les cultures de cellules primaires ou cellule ligne études sont plus adaptés pour fins de sélection et pour réaliser des expériences de types qui ne peuvent être exécutées en vivo ou dans l’intestin perfusé isolé. Par exemple, une véritable force des cultures de cellules primaires et cultures de cellules de ligne est que secondaire intra-cellulaire messagers (p. ex. Ca2 +, cAMP, NAD(P)H) peut être surveillé en temps réel et signalisation électrique de la cellules qui sécrètent l’hormone peut être étudié le20,21,22. En outre, knockdown de siARN peut être fait, ce qui est particulièrement utile si des inhibiteurs spécifiques ne sont pas disponibles20,21,22,23,24. Tissu d’intestin des souris montés dans des chambres de Ussing a récemment été utilisé pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents situé sur la sécrétion stimulée acides biliaires de GLP-1, tout en organoïdes intestinale (de souris) et morceaux d’intestin humain ont également été utilisés pour étudier les détails moléculaires du tube digestif sécrétion de l’hormone17,25. Alors que les premières prestations d’être polarisé2 tous ces modèles comportent des incubations statiques. Études sur des bouts de l’intestin humain, cependant, bénéficient de l’utilisation de tissus humains, plutôt que de rongeurs, ce qui est important comme différence des espèces dans l’expression de tissu de 7mc récepteurs et transporteurs moléculaires peuvent entraîner différentes voies moléculaires de détection entre espèces. En fait, la plupart des données dans ce domaine a été générées par des études sur des porcs, de souris ou de rats, et il reste insaisissable, si ces résultats peuvent être transférées aux humains. Toutefois, il est rassurant que les mécanismes de détection moléculaires qui sous-tendent la sécrétion stimulée par le glucose du GLP-1 semblent être comparables entre souris, rat, man, et transcriptomique et peptidomic identification des souris et de L-cellules humaines a révélé fort global similitudes entre les deux espèces7,18,26,27.
L’intestin grêle de rat isolé et perfusé, cependant, a aussi des limites qui devraient être considérés. Plus important encore, il est impossible de déterminer si une réponse sécrétoire donnée résulte d’une activation directe de la substance d’essai des cellules productrices de l’hormone ciblées est ou plutôt causée par un mécanisme indirect. Par exemple, KCl instantanément augmente la sécrétion de GLP-1 de l’ intestin perfusé7, mais on ne sait toujours pas si c’est une conséquence de la dépolarisation directe de la L-cellule ou résulte de la dépolarisation des neurones à proximité des L-cellules ou des effets de publié simultanément paracrine stimulateurs/inhibiteurs. Données issues d’études utilisant l’intestin perfusé, qui visent à élucider les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la sécrétion, par conséquent, toujours soient mises en contexte avec les données obtenues à partir d’autres modèles plus spécifiques pour augmenter la capacité d’établir lien de causalité. Par exemple, la sécrétion de GLP-1 stimulée par le glucose de la lignée de cellules sécrétrices du GLP-1 GLUTag28,29 et de souris primaire L-cellules dépendent de l’activité des transporteurs de glucose (SGLT1 et GLUT2). Blocage de ces transporteurs dans l’intestin grêle de rat perfusée atténue également la sécrétion20, ce qui signifie qu’il est probable que la sécrétion de GLP-1 stimulée par le glucose est largement médiatisée par les actions directes du glucose sur la cellule de L. Une autre limitation importante de l’intestin isolé perfusé est que certains des lipides sont difficiles à étudier en raison de leur hydrophobicité. Bien qu’il soit possible d’étudier les produits finaux de la digestion des lipides (acides gras, diacyl glycérols, lysophosphatidylglycerols, etc.) et même si la préparation peut être en mesure de re-estérifier les lipides intra- intracellulaires et peut-être les emballer dans les chylomicrons, le transport des chylomicrons hors des cellules et leur adoption ultérieure par les lacteals des villosités est perturbée, puisque la circulation de la lymphe dans l’intestin isolé ne peut pas être sécurisée. Très probablement, par conséquent, absorption des lipides est interrompue une fois que les produits absorbés commencent à s’accumuler dans les cellules. Les systèmes cellulaires in vitro sont encore moins adaptés aux études de lipides en raison de leur manque de polarisation. Évidemment, cette limitation s’applique uniquement des lipides qui sont absorbés et transportés par les lacteals, tandis que ceux absorbé via les vaisseaux sanguins intestinaux sont susceptible d’être traitées normalement.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’intestin grêle de rat perfusée isolé est un outil de recherche performant qui permet la dynamique et les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la sécrétion de l’hormone intestinale à étudier en détail. L’étape la plus critique pour le succès de la production de données avec ce modèle est l’opération chirurgicale. Manipulation de l’intestin entraînera inévitablement des dommages à l’intestin et devrait donc être réduite au strict minimum. Plus important encore, la vitesse de fonctionne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention sans restriction de Prof. Jens Juul Holst depuis le centre de Novo Nordisk recherche métabolique fondamentale (Novo Nordisk Foundation, Danemark), une subvention distincte de la Novo Nordisk Fondation pour faire les études de perfusion rongeur (subvention no. NNF15OC0016574), une subvention de Prof. Holst de l’European Research Council (Grant no.695069) et l’Union européenne est septième Programme-cadre de recherche, de TechnologicalDevelopment et de démonstration (Grant no 266408), mais aussi un post-doctorant accorder aux Rune E. Kuhre de la fondation de Lundbeck (R264-2017-3492). Nous remercions Jenna E. Hunt et Carolyn F. Deacon pour la relecture attentive.
Materials
| Chemicals for perfusion buffer | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 1.12018.0500 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O) | Merck | 102382 | |
| Dextran 70 | Pharmacosmos | 40014 | |
| Fumaric acid disodium salt (C4H2Na2O4) | Sigma Aldrich | F9642 | |
| Glucose (C6H12O6) | Merck | 108342 | |
| Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4) | Merck | 105886 | |
| Potasium chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck | 104873 | |
| Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4) | Merck | 106619 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | ||
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O) | Merck | 106445 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion equitment | |||
| Universial perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | |
| BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834 | Harvard Bioscience, Inc. | ||
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Cannula with basked, OD= 2.0mm, ID= 1.0mm | Harvard Bioscience, Inc. | 733313 |
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