Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

Summary

Questo protocollo descrive un approccio di basato su spettroscopia di fluorescenza fluttuazione per indagare le interazioni tra proteine che mediano interazioni cellula-cellula, cioè proteine localizzate nelle giunzioni delle cellule, direttamente nelle cellule viventi. Forniamo le linee guida dettagliate sulla calibrazione dello strumento, acquisizione dati e analisi, comprese le correzioni al fonti possibili manufatto.

Abstract

Una varietà di processi biologici coinvolge interazioni cellula-cellula, in genere mediati dalle proteine che interagiscono a livello di interfaccia tra le cellule vicine. Di interesse, solo pochi saggi sono in grado di sondare specificamente tali interazioni direttamente nelle cellule viventi. Qui, presentiamo un test per misurare l’associazione di proteine espresse sulle superfici delle cellule vicine, a contatti cellula-cellula. Questo test è costituito da due passaggi: miscelazione delle cellule che esprimono le proteine di interesse fusa a diverse proteine fluorescenti, seguita da misure di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione a contatti cellula-cellula utilizzando un microscopio a scansione confocale del laser. Dimostriamo la fattibilità di questo test in un contesto biologicamente rilevante misurando le interazioni della proteina amiloide precursore-come 1 (APLP1) attraverso giunzioni della cellula-cellula. Forniamo protocolli dettagliati sull’acquisizione dati utilizzando tecniche basate sulla fluorescenza (scansione di spettroscopia di correlazione di fluorescenza, il numero di cross-correlazione e analisi di luminosità) e la taratura dello strumento richiesto. Ulteriormente, discutiamo passaggi critici nell’analisi dei dati e come identificare e correggere le variazioni di segnale esterno, spurie, come quelle dovute a movimenti photobleaching o cella.

In generale, il saggio presentato è applicabile a qualsiasi omo – o interazioni eterotipiche proteina-proteina a contatti cellula-cellula, fra le cellule dei tipi uguali o diversi e può essere implementato su un commerciale scansione microscopio confocale del laser. Un requisito importante è la stabilità del sistema, che deve essere sufficiente per sondare dinamica diffusiva delle proteine di interesse per diversi minuti.

Introduction

Molti processi biologici verificano presso i siti delle interazioni cellula-cellula, per esempio, cellula-cellula adesione^1,2,3, cellula-cellula fusion⁴ e riconoscimento cellulare⁵. Tali eventi sono particolarmente importanti durante lo sviluppo degli organismi multicellulari e per la comunicazione cellula-cellula, per esempio, durante le risposte immunitarie. Questi processi sono in genere mediati dalle proteine che sono localizzate alla superficie, cioè, alla membrana del plasma (PM) delle cellule vicine e sottoposti a specifiche interazioni al contatto cellula-cellula che sono precisamente regolamentato in spazio e tempo. In molti casi, queste interazioni sono diretto omo – o eterotipiche interazioni della proteina-proteina trans , ma possono anche coinvolgere gli ioni o ligandi che agiscono come linker extracellulare¹. Sebbene di fondamentale importanza, c’è una mancanza di saggi sondando queste interazioni proteina-proteina specifica direttamente nell’ambiente nativo di cellule viventi. Molti metodi di distruzione cellulare (ad es., analisi biochimiche come co-immunoprecipitazione⁶), richiedono la fissazione (ad es., alcune delle tecniche di Super-risoluzione microscopia ottica e microscopia elettronica delle cellule contatti⁷), o sono non-specifici, ad esempio, aggregazione / adesione saggi^8,9. Per ovviare a questo problema, sono state implementate tecniche di fluorescenza basata sulla fluorescenza resonance energy transfer (FRET)¹⁰ o fluorescenza complementazione¹¹. Tuttavia, per raggiungere distanze sufficientemente piccole tra fluorofori, questi metodi richiedono etichette fluorescenti sul lato extracellulare delle proteine¹⁰, potenzialmente interferenti con interazioni di trans .

Qui, presentiamo un’analisi di fluorescenza-basata alternativa per le interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula. Questo approccio combina approcci di cross-correlazione di fluorescenza (scansione spettroscopia di correlazione di fluorescenza (sFCCS), numero di cross-correlazione e luminosità (ccN & B)) e la miscelazione delle cellule che esprimono un costrutto di fusione della proteina di interesse, ad esempio, un recettore di adesione. I recettori studiati nelle due cellule interagenti sono etichettati con due proteine fluorescenti spettralmente separate (FPs), dall’intracellulare (Vedi Figura 1A).

I metodi impiegati sono basati sull’analisi statistica delle fluttuazioni di fluorescenza indotta dal movimento diffusivo delle proteine di fusione fluorescenti attraverso il volume focale di un microscopio a scansione confocale del laser. Più in dettaglio, il test sonde co-diffusione delle proteine di interesse in entrambi vicini PMs a contatti cellula-cellula. Se le proteine subiscono interazioni trans , questi complessi trans porterà proteine fluorescenti che emettono in entrambi i canali spettrali, causando fluttuazioni di fluorescenza correlata di entrambi gli emettitori. D’altra parte, se si verifica alcuna associazione, le fluttuazioni numero di proteine nell’affrontare PMs sarà indipendente, non causando fluttuazioni correlate. L’acquisizione può essere eseguita in due modi: 1) sFCCS si basa su una scansione a forma di linea attraverso il contatto cellula-cellula e sonde in modo efficace le interazioni in un punto situato nella regione del Contatta. Attraverso un’analisi temporale delle fluttuazioni di fluorescenza, sFCCS fornisce anche informazioni dinamiche, cioè, i coefficenti di diffusione dei complessi della proteina; 2) ccN & B si basa su un’analisi di immagine di una sequenza di immagini acquisite presso le regioni di contatto cellula-cellula. Esso ha la capacità di sondare e mappa interazioni lungo tutta la regione (in un piano focale) di contatto, ma non fornisce informazioni sulle dinamiche. Entrambi i metodi possono essere combinati con un’analisi della luminosità molecolare, cioè, il segnale di fluorescenza media emessa nell’unità di tempo da complessi proteici diffusore singolo e, quindi, fornire stime della stechiometria dei complessi della proteina a contatti cellula-cellula.

In questo articolo, forniamo dettagliati protocolli per la preparazione del campione, calibrazione dello strumento, acquisizione dati e analisi ad eseguire l’analisi presentata su un commerciale scansione microscopio confocale del laser. Gli esperimenti possono essere eseguiti su qualsiasi strumento dotato di conteggio di fotoni o rivelatori analogici e un obiettivo con apertura numerica elevata. Abbiamo ulteriormente discutere passaggi critici del protocollo e forniscono schemi di correzione per diversi processi che causano fluttuazioni artefactual segnale, ad esempio, rivelatore rumore, movimento photobleaching o cella. Originariamente sviluppato per sondare le interazioni tra cellule aderenti, il dosaggio può essere modificato per cellule in sospensione, o adattati ai sistemi di membrane modello, ad esempio, le vescicole unilamellari gigante (GUV) o plasma gigante vescicole di membrana (GPMVs), che consente la quantificazione delle interazioni in lipidi diversi ambienti o in assenza di un citoscheletro organizzato^12,13.

Spettroscopia di correlazione di fluorescenza di scansione è una versione modificata di spettroscopia di correlazione di fluorescenza¹⁴ ed è stato specificamente progettato per sonda dinamica diffusiva lenta del lipido membrane¹⁵. Si basa su un’acquisizione di scansione linea perpendicolare al PM contenenti le proteine fluorescenti di interesse. Per sondare le interazioni delle due specie di proteina marcata in modo diverso, l’acquisizione viene eseguita in due canali spettrali utilizzando due linee laser e due finestre di rilevamento per fluorofori spettralmente separati. A causa della dinamica lenta diffusione di proteine nel PM (D≤ ~ 1 µm2/s), una misura di cross-talk-free possa essere eseguita alternando lo schema di eccitazione da linea a linea¹⁵. L’analisi inizia con: 1) un algoritmo di allineamento correggere per movimento laterale cellulare basato su block-wise con una media di ~ 1000 righe, 2) determinazione della posizione con fluorescenza massimo segnale, cioè, il PM posizione ogni blocco e 3) mutevole di tutti i blocchi per una comune origine^12,15, separatamente in ciascun canale. Quindi, una selezione automatica dei pixel corrispondenti al PM viene eseguita selezionando la regione centrale da una vestibilità gaussiana della somma di tutte le linee allineate (cioè, centro ± 2.5σ). Integrazione del segnale in ogni linea produce la serie temporale fluorescenza a membrana f (t) in ciascun canale (g = verde canale, r = canale rosso). Nota che la dimensione in pixel deve essere abbastanza piccola, ad esempio, < 200 nm, per ricostruire la forma del punto di diffondere funzione e trovare il suo centro, corrispondente alla posizione del PM. In presenza di sostanziale photobleaching, le serie temporali di fluorescenza in ciascun canale possono essere modellate con una funzione di doppio-esponenziale e poi corretto con la seguente formula:¹⁶

.    (1)

È importante notare che questa formula corregge efficacemente sia le ampiezze e tempi di diffusione ottenuti da analisi di correlazione di f (t)^c, rispetto alle stime dei parametri che si otterrebbe dalla non corretta f (t). Quindi, le funzioni di auto – e cross-correlazione (ACFs / CCFs) della fluorescenza segnali vengono calcolati:

, (2).

, (3).

dove δF_ho = F_io(t) – F_io(t) ed io = g, r.

Un modello bidimensionale diffusione è poi montato su tutte le funzioni di correlazione (CFs):

.   (4)

Qui, N indica il numero di proteine fluorescenti nel volume di osservazione e τ_d il tempo di diffusione per ogni canale. Questo modello prende in considerazione che in ambito sperimentale descritto, diffusione delle proteine nel PM si verifica nel piano x-z, in contrasto con la configurazione comunemente usata di correlazione di fluorescenza spettroscopia (FCS) esperimenti sulle membrane di sondaggio diffusione nel piano x-y del confocale volume¹⁷. La vita w₀ e il fattore di struttura S, descrivendo l’allungamento w_z del volume focale in z, S = wz/w₀, sono ottenuti da una misura di calibrazione punto FCS effettuata con coloranti spettralmente simili e stesse impostazioni ottiche utilizzando valori già disponibili per il coefficente di diffusione D_tintura:

, (5).

dove τ_{d, colorante} è il tempo di diffusione medio misurato delle molecole della tintura, ottenuta da un modello tridimensionale diffusione ai dati, di montaggio tenendo le transizioni di conto di una frazione T di tutte le molecole di N per un stato di tripletto con una costante di tempo τ_τ:

.   (6)

Infine, i coefficenti di diffusione (D), i valori di luminosità molecolare (ε) e la relativa correlazione incrociata dei dati sFCCS (rel.cc.) sono calcolati come segue:

, (7).

, (8).

, (9).

dove G_cross(0) è l’ampiezza della funzione di correlazione incrociata e è l’ampiezza della funzione di autocorrelazione nel canale dei -esima.

Questa definizione della relativa correlazione incrociata, cioè utilizzando max invece di dire all’equazione 9, tiene conto del fatto che il numero massimo dei complessi di due specie proteiche presenti alle concentrazioni differenti è limitato per il specie presenti in un numero inferiore.

Luminosità e il numero di Cross-correlazione si basa su un’analisi del momento dell’intensità di fluorescenza per ogni pixel di una serie di immagini acquisite nel tempo ad un in posizione fisso nel campione, costituiti in genere da ~ 100-200 fotogrammi, con due spettrali canali ( g = verde canale, r = canale rosso). Dalla media temporale ho_{e la varianza} , la luminosità molecolare ε_i e numero n_mi vengono calcolate in ogni pixel e canale spettrale (io = g, r)¹⁸:

, (10).

. (11)

È importante notare che le equazioni determinate si applicano al caso ideale di un vero rilevatore photon-counting. Per sistemi di rivelazione analogica, le seguenti equazioni applicano^19,20:

, (12).

.   (13)

Qui, S è il fattore di conversione tra fotoni rilevati ed i conteggi digitali registrati, è il rumore di lettura e offset si riferisce all’offset di intensità del rivelatore. Generalmente, queste quantità devono essere calibrate, per qualsiasi tipo di rivelatore, basato su misura la varianza del rivelatore in funzione dell’intensità per illuminazione costante¹⁹, ad esempio, una superficie di metallo riflettente o soluzione colorante secchi. L’ offset può essere determinato misurando la velocità di conteggio per un campione senza luce di eccitazione. Eseguendo una regressione lineare della varianza rivelatore-associated versus trama di intensità (mi), S e può essere determinato¹⁹:

.   (14)

Infine, la luminosità di cross-correlazione è calcolata in ogni pixel ed è definita in generale come²¹

, (15).

dove è la croce-varianza .

Per filtrare le fluttuazioni longeve, tutti ccN & calcoli B vengono eseguiti seguendo un vagone coperto del filtro, in modo indipendente per ogni pixel²². Brevemente, n_i, ε_ho (ho = g, r) e B_cc sono calcolati in segmenti di ad esempio, 8-15 infissi scorrevoli. I valori così ottenuti possono essere fatte la media poi per ottenere il pixel finale numero e la luminosità.

Analisi di stechiometria
Al fine di stimare la stechiometria dei complessi della proteina a contatti cellula-cellula, la luminosità molecolare possa essere analizzata separatamente in ciascun canale spettrale per il sFCCS o ccN & dati B. In sFCCS, si ottiene un valore di luminosità per misura in ciascun canale. In ccN & B, si ottiene un istogramma di luminosità di tutti i pixel corrispondenti al contatto cellula-cellula e il valore medio (o mediano) può essere utilizzato come luminosità rappresentativo per la misurazione. Eseguendo la stessa analisi su un riferimento monomerico, tutti i valori di luminosità possono essere normalizzati per ottenere direttamente lo stato oligomerico medio dei complessi proteici rilevati. A questo punto, è importante correggere per la presenza di FPs non fluorescente che può comportare una sottovalutazione dello stato oligomerico. Questo viene in genere eseguito misurando la luminosità di un homo-dimerica riferimento proteina^23,24 utilizzando SFC un colore o numero e luminosità (N & B).

Protocol

1. preparazione del campione: Cella di miscelazione dosaggio Nota: Il seguente protocollo descrive la procedura di miscelazione per le celle aderenti. Può essere modificato per le cellule coltivate in sospensione. Un numero adeguato di cellule su una piastra a 6 pozzetti, per esempio, 800.000 cellule HEK 293T (contati con un Neubauer camera di conteggio), un giorno prima di transfezione del seme. Il numero può essere modificato a seconda del periodo tra la semina e la tran…

Representative Results

Un primo test per il dosaggio di interazione proteina-proteina, cioè, miscelazione delle cellule che esprimono le proteine fluorescenti spettralmente distinte seguite da sFCCS/ccN & misure B (Figura 1), deve essere eseguita sulle proteine che non sono tenute a interagire al contatto cellula-cellula (cioè, un controllo negativo). Di conseguenza, le cellule HEK 293T che esprimono miristoilate-palmitoilata-mEYFP (myr-palm-mEYFP) o – mCardinal…

Discussion

La procedura sperimentale descritta qui permette l’indagine su proteine trans interazioni a contatti cellula-cellula, che impiegano tecniche di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione, vale a dire sFCCS e ccN & B. Questi metodi implicano un’analisi statistica delle fluttuazioni di fluorescenza emessa da FPs spettralmente separati due fusi per la proteina di interesse a un contatto di due cellule vicine, ognuno esprimendo la una o l’altra proteina di fusione. La presenza di complessi trans è quantifi…

Materials

DMEM growth medium	PAN-Biotech	P04-01548
DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+	PAN-Biotech	P04-36500
DPBS w: Ca2+ and Mg2+	PAN-Biotech	P04-35500
Trypsin EDTA	PAN-Biotech	P10-023100
TurboFect Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	R0531
HEK 293T cells	DSMZ	ACC 635
Alexa Fluor 488 NHS Ester	Thermo Fisher Scientific	A20000
Rhodamine B	Sigma-Alderich	83689-1G
Plasmid DNA	Addgene	NA	See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids
6-well plate	Starlab	CC7672-7506
35-mm glass bottom dishes	CellVis	D35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 confocal	Carl Zeiss	NA
MATLAB software package	MathWorks	2015b
Neubauer cell counting chamber	Marienfeld	640110