Het meten van veranderingen in de stofwisseling staat centraal in het begrijpen van de progressie van verschillende ziektes en veroudering. Hier presenteren we een nieuwe techniek voor het meten van de hele hoofd zuurstofverbruik dat nauwer lijkt op de fysiologische toestand en kan steun bij het openbaren van nieuwe medicijnen die mitochondriale activiteit wijzigen.
Gereglementeerde metabole activiteit is essentieel voor de normale werking van levende cellen. Inderdaad, is de gewijzigde metabole activiteit causaal verbonden met de progressie van kanker, diabetes, neurodegeneratie en veroudering om enkelen te noemen. Bijvoorbeeld, wijzigingen in mitochondriale activiteit, metabole powerhouse van de cel, gekenmerkt in veel van dergelijke ziekten. In het algemeen, de zuurstof verbruik van mitochondriën werden beschouwd als een betrouwbare uitlezing van mitochondriale activiteit en metingen in een aantal van deze studies zijn gebaseerd op geïsoleerde mitochondriën of cellen. Dergelijke voorwaarden kunnen echter niet de complexiteit van een hele weefsel vertegenwoordigen. Onlangs hebben wij een nieuwe methode waarmee de dynamische meting van zuurstof verbruik van geheel geïsoleerde vliegen koppen ontwikkeld. Door gebruik te maken van deze methode, hebben we lagere tarieven van de consumptie van de zuurstof van het hele hoofd segment vastgelegd in jonge versus leeftijd vliegen. Ten tweede hebben we ontdekt dat lysine deacetylase remmers snel veranderen als u het zuurstofverbruik in het hele hoofd. Onze nieuwe techniek kan daarom steun bij het blootleggen van de nieuwe eigenschappen van verschillende drugs, die mogelijk van invloed op stofwisseling. Bovendien kan onze methode geven een beter begrip van metabolische gedrag in een experimentele opzet dat nauwer lijkt op fysiologische staten.
Gereglementeerde metabole activiteit is essentieel voor het overleven van de cellen en gezonde functie van een weefsel. Gedereguleerde metabole activiteit is uitvoerig aangetoond moet worden gekoppeld aan het ontstaan en de progressie van verschillende maladies1. Bijvoorbeeld lagere metabole activiteit was eerder beschreven in neurodegeneratieve ziekten zoals Alzheimer en leeftijd-geassocieerde geheugen bijzondere waardevermindering2,3. Bovendien, mitochondriale dysfunctie wordt verondersteld te zijn causaal betrokken in het veroudering proces4,5. Aan de andere kant, werden hogere tarieven van mitochondrial en metabole beschreven in kanker cellen6, waar het gebruik van mitochondriale remmers tumorvorming7verminderd.
Één uitlezing van metabole activiteit is het zuurstof verbruik (OCR) mitochondria. Interessant is dat dit soort uitlezing wordt hoofdzakelijk verkregen uit geïsoleerde mitochondriën of cellen, dus de meerderheid van wat wordt beschreven in de literatuur is hoofdzakelijk gebaseerd op een uitlezing die niet lijken op de fysiologische staat. Er zijn echter ook verschillende nadelen aan deze techniek. Ten eerste, het protocol van mitochondriale isolatie kan beschadigen zijn integriteit8, die een relevante artefact wellicht bij het vergelijken van de mitochondriën geïsoleerd van jonge versus oudere weefsels9. Bovendien, het proces van isolement is lang en kan leiden tot verlies van relevante eiwit posttranslationele modificaties tot regeling van de mitochondriale functie9,10,11. Bovendien is gebleken dat geïsoleerde mitochondria niet consequent hele weefsel stofwisseling12,13vertegenwoordigen. Dergelijke cellulaire biologische complexiteit kan worden gezien als ‘het geheel is groter dan de som der delen’, dat wil zeggen, de mitochondriën verschillende stofwisseling in een complexe cel in vergelijking met hun stofwisseling als geïsoleerd kunnen worden weergegeven.
Terwijl de cellen kunnen een beter OCR-uitlezing dan geïsoleerde mitochondriën aanbieden, kunnen de cel naar cel communicatie in het kader van een hele weefsel verloren gaan. Bijvoorbeeld, is de metabole activiteit van neuronen in de hersenen, sterk afhankelijk zijn van de metabole activiteit van naburige gliacellen14. Als zodanig kan tot de oprichting van nieuwe technieken te onderzoeken OCR in hele weefsel of hele organismen blijken meer inzicht voor het ontstaan en de progressie van verschillende aandoeningen.
Onlangs, nieuwe technieken opgedoken deze kwesties en het inschakelen van de meting van OCR uit hele weefsel, segment of levende organismen. Bijvoorbeeld, meldde een recente werk de zuurstof meting van een kever vlucht spier met behulp van een permeabel vezel aanpak met een respirometer15. Nieuwe machines voor micro-respirometrie toestaan de meting voor OCR van alvleesklier eilandjes16,17. Dus, het is gemeld dat deze technologie het meten van OCR van hele wormen18 en19van de zebravis maakt. De aanwezigheid van de spijsvertering barrière vormen echter een uitdaging voor het testen van verschillende drugs in de context van OCR wijzigingen. Interessant, hebben de recente verslagen van Neville en collega’s een nieuwe techniek voor het meten van één drosophila larve hersenen met de goed plaat20,21aangetoond.
In deze studie hebben we een soortgelijke setup gebruikt om de meting van hele OCR van hele levens- en niet-mobiele Drosophila22. Deze techniek biedt ook een secundaire voordeel in het meten van de impact van verschillende drugs op de metabole activiteit in een hele segment, zonder het passeren van het spijsverteringsstelsel barrière13,22. Bijvoorbeeld, werd eerder aangetoond dat directe inspuiting van lysine deacetylase remmer (KDACi), een drug geloofde te wijzigen epigenetische mechanisme in de hersenen, resulteerde in een verbeterde herinneringen vorming23. Echter, met behulp van onze nieuwe techniek, ontdekten we dat KDAC inhibitie in een snelle stijging van OCR resulteerden, die kunnen zijn een bijdragende factor door zelf in de neuronale activiteit. Ons protocol biedt een eenvoudige en nieuwe methode voor de beoordeling van de gevolgen van verschillende drugs, genetische manipulatie of fysiologische staten (ziekte, veroudering) op OCR in het kader van een hele hoofd.
Onze nieuwe techniek biedt een nieuwe benadering om te bestuderen van metabole veranderingen in veroudering en ziekte in het kader van geheel vliegen hoofd segmenten22. De methode kan ook geschikt zijn om te bestuderen van de impact van KDAC natrium butyraat op zuurstofverbruik. Zoals we hebben aangetoond, resulteren lysine deacetlyase remmers (HDACs/KDACs) in wijzigingen van de OCR. In wezen, zoals de doelstellingen van deze remmers zijn normaal gesproken niet gelokaliseerd in de mitochondriën (deze remmers hebben geen invloed op de klasse III deacetylases, de Sirtuins)24, dergelijke drugs kunnen alleen worden getest op een minstens weefsel niveau. Inderdaad, zijn verschillende drugs geïnjecteerd rechtstreeks naar de hersenen, dus het omzeilen van mogelijke verwerking/wijziging/inactivering van het spijsverteringsstelsel. Als zodanig, biedt onze techniek nieuwe inzicht in hoe dergelijke drugs rechtstreeks gevolgen het hoofd segment.
Er zijn verschillende kritische stappen. Ten eerste, zoals in het protocol, raden we voorbereiding een plaat van minder dan een uur, met twee paar handen voorbereiding van de plaat. Uit onze ervaring zijn de kwaliteit en de stabiliteit van de OCR-metingen beter bij de voorbereiding op een tijdige manier. Bij het nemen van te lang, toeneemt het voorkomen van lage OCR consumeren wells, is naast de kortere duur van stabiele OCR. Ten tweede is het belangrijk om te voeren een kwaliteitscontrole en ervoor zorgen dat de experimentele omstandigheden tussen de verschillende monsters zijn vergelijkbaar (pH, zuurstofniveaus). Tot slot, een cruciale stap is het kiezen van het juiste algoritme voor het analyseren van de monsters. Zoals we hebben aangetoond, leverde het standaard AKOS algorithme een misleidende en soms tegengestelde berekening in monsters die zuurstof op hoge13 verbruikt. Daarom benadrukken wij het belang van de ruwe gegevens voor zuurstofniveaus controleren en vergelijken van de resulterende OCR.
Momenteel zijn er enkele beperkingen met deze techniek. Bij kamertemperatuur, de machine verwarmt tot 31 ° C (dit is de minimale meettemperatuur terwijl de machine bij kamertemperatuur), die een staat van stress voor de vliegen hoofden25kan vertegenwoordigen. Dit nochtans kan worden verholpen door het plaatsen van de machine in een koude kamer, waardoor metingen bij 25 ° C en dus zonder de stress van een mogelijke warmte om de vliegen hoofden. Recent rapport heeft aangetoond dat de machine bij 11 ° C, waardoor de opname van de OCR van vliegen bij 25 ° C21plaatsen. Niettemin, de vliegen hoofd scheiding moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. Anderzijds temperatuurschommelingen maken het uitdagend om controle pH wijzigingen en daarom is het sterk aanbevolen om het effect van fysiologische omstandigheden/drugs op OCR testen met behulp van soortgelijke experimentele opstellingen. Bovendien is de bijdrage van zuurstofverbruik door niet-mitochondriale-zelfstandige mechanismen nog geen gevestigde26. Met behulp van verschillende respiratoire remmers die efficiënt in vliegen hoofden, zou het mogelijk zijn om vast te stellen van dergelijke niet-mitochondriale zuurstof verbruik.
Het is opmerkelijk dat verschillende zoogdieren maladies worden gekenmerkt door veranderingen in het energiemetabolisme. Onder hen zijn ziekten die worden gekenmerkt door ofwel metabole korting zoals de ziekte van Alzheimer of metabole herbedradingsproces zoals kanker. Interessant, worden KDAC-remmers gebruikt voor zowel de ziekte van Alzheimer en kanker behandeling27. Hoewel de precieze mechanismen door welke KDAC remmers zijn het bereiken van het therapeutische aspect onduidelijk blijven, ondersteunt de gegevens van onze techniek het nieuwe begrip dat dergelijke remmers metabolisme kunnen moduleren.
Kortom is deze methode waardevol voor het meten van totale zuurstofverbruik tarieven in vivo en meer toont nauwkeurig drug effecten op het algemene metabolisme, die in geïsoleerde mitochondriën protocollen12kan worden genegeerd. Bijvoorbeeld, hebben de resultaten van deze methode, in plaats van eerdere technieken, nieuwe inzichten voor leeftijd-geassocieerde metabole inflexibiliteit op een KDAC behandeling betrokken. Meerwerk is noodzakelijk voor het optimaliseren van de experimentele omstandigheden voor vliegen hoofden, de combinatie van onze techniek en geschikt analyse kan leiden tot verdere opheldering van de mitochondriale activiteit in het kader van de hele levende weefsels.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Andreas Ladurner, Carla Margulis en hun teams voor uitgebreide experimental support. Wij danken Caitlin Ondracek voor haar opmerkingen over het manuscript. We zouden graag bedanken Sofia Vikstrom voor ons te helpen bij het vaststellen van de vroege fasen van deze techniek. Wij danken ook kan Sanderhoff voor haar technische hulp. LB wordt gefinancierd door het Duitse federale ministerie van onderwijs en onderzoek (Infrafrontier grant 01KX1012). SP werd gefinancierd door een AXA onderzoeksfonds postdoctoral fellowship en het NSFC (Grant nummer 81870900). AVV is gefinancierd door de QBM.
Glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered |
XF assay Medium | Agilent | 103575-100 | Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4 |
Sodium butyrate | Merck | 817500 | Dissolved in XF assay buffer |
Seahorse XF24/e24 analyzer | Agilent | ||
XF24/e24 Extracellular Assay Kit | Agilent | 100850-001 | Cartridge |
XF24/e24 Islet Capture Microplates | Agilent | 101122-100 | Plate |
Seahorse Capture Screen Insert Tool | Agilent | 101135-10 | Insertor |
Petri dish | Sarstedt | 821,472 | Petri dish 92 x 16 mm |