מדידת שינויים בשערי מטבולית הוא מרכזי להבנת ההתקדמות של הזדקנות ומחלות שונות. כאן, אנו מציגים טכניקה חדשנית כדי למדוד את צריכת החמצן כל הראש באופן הדוק יותר דומה המדינה פיזיולוגיים, עשויים לסייע בגילוי תרופות חדישות לשנות פעילות מיטוכונדריאלי.
פעילות מטבולית מוסדר חיוני לתפקוד תקין של תאים חיים. אכן, פעילות חילוף החומרים שונה סיבתי מקושר עם התקדמות סרטן, סוכרת, הקשורים ניוון מוחיים, הזדקנות שם כמה. למשל, שינויים בפעילות מיטוכונדריאלי, תחנת כוח חילוף החומרים של התא, יש כבר מאופיין במחלות רבות כגון. באופן כללי, שיעור צריכת החמצן של המיטוכונדריה נחשבו readout אמין פעילות מיטוכונדריאלי, מדידות בכמה מחקרים אלו התבססו על המיטוכונדריה מבודד או תאים. עם זאת, בתנאים לא מייצג את המורכבות של כל רקמה. לאחרונה פיתחנו שיטה המאפשרת המדד הדינמי של חמצן קצב הצריכה של מנהלי לטוס מבודד לגמרי. באמצעות שיטה זו, הקלטנו שיעורי צריכת חמצן נמוכה של המקטע כל ראש צעיר לעומת בגילאי בזבובים. שנית, גילינו כי מעכבי deacetylase ליזין לשנות במהירות את צריכת החמצן בראש כל. הטכניקה הרומן שלנו עשויים לסייע לכן חשיפת מאפיינים חדשים של תרופות שונות, אשר עשויים להשפיע על קצב חילוף החומרים שיש. יתר על כן, שיטת שלנו עשוי לתת הבנה טובה יותר של התנהגות מטבולית התקנה ניסיונית הדומה יותר מצבים פיזיולוגיים.
פעילות מטבולית מוסדר חיוני עבור ההישרדות של תאים ותפקוד בריא של רקמה. ושוחררו פעילות מטבולית הוכח באופן נרחב כדי להיות מקושר את תחילת ואת ההתקדמות של מחלות שונות1. לדוגמה, פעילות חילוף החומרים התחתון היה שתואר קודם לכן מחלות ניווניות כגון אלצהיימר ו-2,ליקוי זיכרון הקשורות לגיל3. יתר על כן, תפקוד מיטוכונדריאלי הוא האמין להיות מעורב סיבתי4,תהליך ההזדקנות5. מצד שני, המחירים גבוהים יותר מיטוכונדריאלי וחילוף מתוארים סרטן תאים6, שבו השימוש של מעכבי מיטוכונדריאלי מופחת tumorigenesis7.
אחד readout פעילות חילוף החומרים הוא שיעור צריכת החמצן (OCR) של המיטוכונדריה. מעניין, סוג זה של הבדיקה מתקבל בעיקר המיטוכונדריה מבודד או תאים, ובכך את רוב מה מתואר בספרות מתבסס בעיקר על הבדיקה שאינו דומה המדינה פיזיולוגיים. עם זאת, ישנם מספר חסרונות כדי בטכניקה זו. ראשית, הפרוטוקול של בידוד מיטוכונדריאלי יכול שעלולים לגרום נזק שלה תקינות8, אשר עשוי להיות הפריט הרלוונטי בהשוואת המיטוכונדריה מבודד צעירים לעומת מבוגרים רקמות9. יתר על כן, תהליך בידוד ארוכה, עלול לגרום לאובדן של שינויים posttranslational חלבון רלוונטיים אשר לווסת את הפונקציה מיטוכונדריאלי9,10,11. יתר על כן, הוכח כי המיטוכונדריה מבודדים אינם מייצגים באופן עקבי כל רקמות קצב חילוף החומרים שיש12,13. המורכבות הביולוגית הסלולר כזה יכול להיחשב, “השלם הוא יותר מסכום חלקיו”, קרי, המיטוכונדריה עשוי להציג שיעורי מטבוליים שונים בתוך תא מורכב לעומת קצב חילוף החומרים שלהם כאשר מבודדים.
בעוד תאים עשוי להציע readout OCR טובה יותר מאשר המיטוכונדריה מבודד, תקשורת לתא בהקשר של כל רקמה יאבדו. לדוגמה, במוח, הפעילות המטבולית של נוירונים הוא תלויים במידה רבה הפעילות המטבולית של תאי גליה שכנות14. ככזה, הקמת טכניקות חדשות לחקור OCR ברקמה שלם או אורגניזם שלם עשוי להוכיח יותר נבונה כדי להפוך את תחילת התפתחות הפרעות שונות.
לאחרונה, טכניקות חדשות הופיעו בבעיות אלה ולאפשר את המדידה של OCR כל רקמות, קטע או אורגניזמים חיים. לדוגמה, עבודה אחרונים דיווח המדידה החמצן של שריר טיסה חיפושית באמצעות גישה סיבים permeabilized עם respirometer15. מכונות חדשות עבור מיקרו-respirometry לאפשר את המדידה של OCR לנגרהנס16,17. כתוצאה מכך, בעבר דווח כי טכנולוגיה זו מאפשרת מדידת OCR של תולעים כל18 ודג זברה19. עם זאת, הנוכחות של המכשול העיכול עלולה להוות אתגר עבור בדיקות סמים שונים בהקשר של שינויים OCR. מעניין, דיווחים אחרונים מאת נוויל ועמיתיו הראו בטכניקה חדשה למדידת דרוזופילה יחיד המוח זחל עם צלחת טוב20,21.
במחקר זה, השתמשנו מלכודת דומה כדי לאפשר את המדידה של OCR כל החיים, בפירוקי דרוזופילה22. טכניקה זו מציעה גם יתרון משניים למדידת ההשפעה של תרופות שונות על פעילות חילוף החומרים של מקטע שלם, מבלי לעבור דרך מערכת העיכול מכשול13,22. לדוגמה, בעבר הוכח כי ישיר הזרקה של ליזין deacetylase מעכב (KDACi), תרופה האמין לשנות מנגנון epigenetic במוח, כתוצאה של היווצרות זיכרונות משופרת23. עם זאת, באמצעות הטכניקה הרומן שלנו, גילינו כי עיכוב KDAC הביא לעלייה מהירה OCR, אשר עשוי להוות גורם מסייע בפני עצמו בפעילות העצבית. פרוטוקול שלנו מספק שיטה פשוטה הרומן לאמוד את ההשפעה של תרופות שונות, מניפולציה גנטית או מצבים פיזיולוגיים (מחלות, הזדקנות) על OCR בהקשר של ראש.
הטכניקה החדשה שלנו מציע גישה מוזרה ללמוד שינויים מטבוליים הזדקנות ומחלות בהקשר של מקטעי ראש כל זבוב22. השיטה יכול להיות מתאים גם לחקור את ההשפעה של KDAC butyrate נתרן על צריכת החמצן. כפי שאנחנו הדגימו, מעכבי deacetlyase ליזין (HDACs/KDACs) גורמות לשינויים OCR. בעיקרו של דבר, כפי המטרות של מעכבי כזה בדרך כלל לא מותאמים המיטוכונדריה (מעכבי אלה לא משפיעים על deacetylases Class III, Sirtuins)24, תרופות מסוג זה יכול לבדוק רק על לפחות ברמת רקמות. אכן, תרופות שונות מוזרקים ישירות למוח, ובכך לעקוף אפשרי עיבוד/שינוי/איון על ידי מערכת העיכול. ככזה, הטכניקה שלנו מציע תובנה הרומן איך כגון סמים ישירות השפעה על קטע ראש.
ישנם מספר שלבים קריטיים. ראשית, כאמור בפרוטוקול, אנו ממליצים הכנת צלחת מתחת שעה אחת, עם שני זוגות ידיים מכין את הצלחת. מהניסיון שלנו, איכות ויציבות של המדידות OCR טובים יותר כאשר שהוכנו מבעוד. כאשר לוקחים יותר מדי זמן, המופע של בארות רב OCR נמוכה היא הגדלת, כמו גם משך קצר יותר של OCR יציב. שנית, חשוב לבצע בדיקת איכות ולהבטיח כי התנאים ניסיוני בין מדגמים שונים הם דומים (pH, רמות חמצן). לבסוף, שלב קריטי הוא בחירת אלגוריתם הנכון כדי לנתח את הדגימות. כמו, הראו אלגוריתם מאור כהנא כברירת מחדל הניב חישוב מטעה ואף לעיתים מנוגדות הדגימות אשר לצרוך חמצן-שיעור גבוה13. לכן יש להדגיש את החשיבות של בדיקת הנתונים הגולמיים עבור רמות החמצן והשוואה בין OCR התוצאה.
כיום, ישנן מספר מגבלות בטכניקה זו. בטמפרטורת החדר, מחממת המכונה עד 31 ° C (זוהי מדידת הטמפרטורה מינימלית אמנם המכונה בטמפרטורת החדר), אשר עשוי לייצג מדינה מתח עבור ראשי לטוס25. זה אולם ניתן להתגבר על ידי הצבת המכונה בחדר קר, אשר יאפשר מידות 25 ° c, ומכאן ללא עומס החום אפשרי ראשי לעוף. לאחרונה דווח הוכיחה הצבת המכונה ב 11 ° C, ובכך מאפשר את ההקלטה OCR של הזבובים-25 ° C21. עם זאת, ההפרדה הראש לטוס צריכה להתבצע בטמפרטורת החדר. יתר על כן, תנודות הטמפרטורה דבר מאתגר את פקד ה-pH משתנה, ולכן מומלץ מאוד לבחון את ההשפעה של מצבים פיזיולוגיים/סמים על OCR באמצעות setups ניסיוני דומה. בנוסף, התרומה של צריכת החמצן על ידי מנגנונים שאינם מיטוכונדריאלי-שאינו תלוי לא התקבלה עדיין הוקמה26. בעזרת מעכבי נשימה שונים כי הם יעילים בראש לעוף, אפשר היה להקים כזה המחירים צריכת חמצן מיטוכונדריאלי.
ראוי לציין כי מחלות יונקים שונים מאופיינים על ידי שינויים בחילוף החומרים אנרגיה. ביניהם הם מחלות המאופיינת על ידי או הפחתת מטבולי כמו מחלת אלצהיימר או מטבוליות הטיפולי כגון סרטן. מעניין, מעכבי KDAC משמשים עבור טיפול של מחלת אלצהיימר וסרטן –27. בעוד המנגנון המדויק על ידי איזה KDAC מעכבי משיגים את ההיבט הטיפולי אינן ברורות, הנתונים מכל הטכניקה שלנו תומך הרעיון חדשניים כגון מעכבי יכול לווסת את חילוף החומרים.
לסיכום, שיטה זו היא בעל ערך עבור מדידת צריכת החמצן הכוללת שיעורי ויוו , יותר מציג במדויק השפעות סמים על חילוף החומרים, אשר עשויים להתעלם המיטוכונדריה מבודד פרוטוקולים12. לדוגמה, התוצאות המתקבלות מן זו שיטה, ולא טכניקות הקודם, לסבך תובנות חדשניים עבור גיל-הקשורים ביחס לתביעותיה המטבולית על טיפול KDAC. בעוד עבודה נוספת יש צורך לייעל התנאים ניסיוני עבור לעוף ראשים, השילוב של הטכניקה שלנו וניתוח מתאים עלול להוביל הבהרה נוספת של הפעילות מיטוכונדריאלי בהקשר של רקמות החיים.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים אנדריאס Ladurner, קרלה מרגוליס והצוותים שלהם לתמיכה נרחבת ניסיוני. אנו מודים Ondracek קייטלין על הערות על כתב היד. ברצוננו להודות סופיה Vikstrom לסייע לנו בהקמת השלבים המוקדמים של טכניקה זו. אנו מודים גם ייתכן Sanderhoff עזרה טכנית. LB ממומן על ידי הגרמני הפדרלי במשרד החינוך והמחקר (Infrafrontier גרנט 01KX1012). SP מומן על ידי הבתר של קרן מחקרים AXA ולא את NSFC (מענק מס ‘ 81870900). AVV ממומן על ידי QBM.
Glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered |
XF assay Medium | Agilent | 103575-100 | Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4 |
Sodium butyrate | Merck | 817500 | Dissolved in XF assay buffer |
Seahorse XF24/e24 analyzer | Agilent | ||
XF24/e24 Extracellular Assay Kit | Agilent | 100850-001 | Cartridge |
XF24/e24 Islet Capture Microplates | Agilent | 101122-100 | Plate |
Seahorse Capture Screen Insert Tool | Agilent | 101135-10 | Insertor |
Petri dish | Sarstedt | 821,472 | Petri dish 92 x 16 mm |