In diesem Artikel zeigen wir wie die absorbierenden Microbiopsy-Technik durchgeführt wird und wie die Probe für die RNA-Extraktion für einfache und gleichzeitige Probenahme von Haut und Blut in einer minimal-invasive Weise verwendet werden kann.
Konventionelle Hautbiopsie schränkt die klinische Forschung, die kosmetisch empfindlichen Gebieten oder pädiatrischen Anwendungen aufgrund ihrer Invasivität beinhaltet. Hier beschreiben wir das Protokoll für die Verwendung einer absorbierenden Microneedle-basierten Gerät, saugfähige Microbiopsy für minimal-invasive Probenentnahme von Haut und Blut-Gemisch. Unser Ziel ist es, rasche Fortschritte in der klinischen Forschung, die Einrichtung von Biomarkern für Hautkrankheiten und Verringerung des Risikos für die klinische Forschungsteilnehmer erleichtern. Im Gegensatz zu herkömmlichen Haut Biopsie-Techniken die saugfähige Microbiopsy kann innerhalb von Sekunden durchgeführt werden und erfordert keine Intensivtraining durch ihr schlichtes Design. In diesem Bericht beschreiben wir die Verwendung von saugfähigen Microbiopsy, einschließlich Beladung und Anwendung auf freiwilliger. Dann zeigen wir wie Sie RNA aus der absorbierten Probe isolieren. Zu guter Letzt zeigen wir die Verwendung von quantitativen reversen Transkription PCR (RT-qPCR), mRNA Ausdruck Niveaus von Blut (CD3E und CD19) und Haut (KRT14 und TYR) zu quantifizieren. Die Methoden, die wir beschreiben, nutzen aus dem Regal-Kits und Reagenzien. Dieses Protokoll bietet einen minimal-invasiven Ansatz für simultane Abtastung von Haut und Blut innerhalb der gleichen absorbierenden Microbiopsy-Matrix. Wir haben menschliche Ethik-Kommissionen, Kliniker und Freiwillige zu unterstützen dieses Ansatzes für die dermatologische Forschung gefunden.
Hautbiopsie ist eines der wichtigsten Techniken in der Dermatologie für die Probenahme der Haut und nachfolgende Diagnose von Hauterkrankungen durch histopathologische Beurteilung. Die Biopsie Technik beinhaltet eine medizinische Fachkraft, die mit einer Klinge oder Punch Biopsie um die verdächtige Läsion auf der Haut des Patienten für Prüfung1zu entfernen. Obwohl die Technik wirksam ist, ist sehr invasiv und klinischen Forschung begrenzt, da der Endpunkt in der Regel molekularbiologischen Techniken2,3beinhaltet. Molekulare Analyse von Hautkrankheiten hat das Potenzial, histopathologische Analyse kann nicht, und erleichtert so Drug Discovery und Krankheit Diagnose4,5, hochspezifische biologische Informationen bereitstellen. Außerdem kann die Probe-Nachfrage in den molekularen Techniken ist vergleichsweise gering und führen zu einem Rückgang der Tiernutzung und erlauben eine größere Anzahl von Wiederholungen. Deshalb gibt es eine klare Notwendigkeit eine alternative Technik, die molekulare Analyse in der klinischen Forschung ermöglicht und senkt Risiko für die Teilnehmer.
Um ein solches Bedürfnis im Bereich zu begegnen, hat unsere Gruppe entwickelt eine neuartige Microneedle-basierte Diagnoseplattform, saugfähige Microbiopsy, die die Sammlung von einer winzigen Menge an Haut vermischt mit Blut in eine einfache und minimal-invasive Weise6ermöglicht. Diese Publikation dient zum saugfähige Microbiopsy als Sampling Tool für molekulare Analyse durch RNA-Extraktion in der klinischen Forschung beschreiben.
Bisher haben wir die erste Version des Microbiopsy, Haut Microbiopsy, beschrieben, besteht aus einer Mikronadel machte eine Stahlplatte Dreischicht-Design, winzige Stückchen Haut Gewebe7zu extrahieren. Die Neuheit dieses Gerätes kommt durch mehrere Kontaktstellen von der Microneedle, die effiziente Gewebe Extraktion3ermöglicht. Im Gegensatz dazu eine kreisförmige Haut Stanzbiopsie bietet nur eine Anlaufstelle und einfach reißt die Haut ohne jede Probe in einigen Fällen erfassen. Basierend auf der Haut Microbiopsy, entwickelten wir vor kurzem die saugfähige Microbiopsy, die Blut und Haut sampling-Funktionen hat. Das Gerät hat sich gezeigt, zur Verwendung in ressourcenarmen Bereichen in einem jüngsten epidemiologischen Studie6realisierbar.
Aufgrund des einfachen Designs saugfähige Microbiopsy kann innerhalb weniger Sekunden durchgeführt werden und erfordert keine Schulung. Zusätzlich örtlicher Betäubung ist nicht erforderlich, und die Applikationsstelle verursacht keine Narben. Dieses Protokoll ermöglicht Forscher oder Mediziner ohne relevante Sampling training, gezielte Hautdaten für die molekulare Analyse zu erhalten. Wir erwarten Microsampling Geräte in Zukunft zur Routine in der Hautforschung.
Obwohl die Microbiopsy in anderen Haut-Krankheit-Studien berichtet worden ist, die molekularen Diagnosetechniken6,8,9,10, wie HPV-DNA-Nachweis, dieses Protokolls beteiligt ist die erste, der die Details der Probe Gewinnung und Verarbeitung Techniken für saugfähige Microbiopsy zu demonstrieren. Darüber hinaus ist dies der erste Bericht beschreibt die relative gen Ausdruck Profilierung von Haut und Blut Zellen in Microbiopsy Proben.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die saugfähige Microbiopsy als Werkzeug für einfach und minimal-invasive Probenentnahme von Haut und Blut-Gemisch für molekulare Charakterisierung verwendet werden kann. Geräteanwendung gemäß unserem Protokoll ist Voraussetzung für zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, wie gezeigt durch die Betragsdifferenz RNA erholte sich mit verschiedenen Anwendungsprotokolle (Abbildung 3). Sobald die Probe entnommen wird, ist die anschließende Probe Verarbeitung Schritt für RNA-Extraktion etablierte Protokolle15,16sehr ähnlich. Außerdem von den ersten Schritten in der RNA-Extraktion, die für die saugfähige Microbiopsy geändert werden, ist eine weitere wichtige Änderung die Verwendung von RNase-freies Wasser zur Verbesserung der Ergebnisse für downstream-Anwendungen. Darüber hinaus ist es erwähnenswert, dass in dieser Studie verwendeten Referenz-gen RPLP0. RPLP0, dessen Funktion für andere Zelle und Gewebe-Typen17bekannt ist, wurde als geeignete Referenz-gen für den Einsatz in nicht-Melanom-Hautkrebs und präkanzerösen Läsionen18berichtet.
Eine der wichtigsten Einschränkungen des Geräts ist die Entfernung von der Microbiopsy aus dem Gerät, das ist zeitaufwändig und potenziell erhöht die Wahrscheinlichkeit von Probenverlust, speziell für empfindliche Proben wie RNA. Allerdings kann das Problem durch Vorkühlung sterile Verarbeitung alles, wie die 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen auf Trockeneis überwunden werden.
Die Verwendung von absorbierenden Microbiopsy ist einfach und erfordert keine intensiven Trainings. Konventionellen Biopsie ist nicht notwendig, da Microbiopsy molekulare Charakterisierung mit etablierten molekulargenetische Diagnostik-Techniken, wie RT-qPCR erlaubt. Um weiter zu quantifizieren und demonstrieren die Probenahme-Fähigkeit der saugfähige Microbiopsy, wurde bisherigen Literatur, die RNA-Extraktion aus Menschenhaut Gewebe beteiligt untersucht. Aus einem typischen 3.0 oder 4.0 mm Haut Stanzbiopsie, drei Studien haben berichtet der extrahierten RNA-Mengen reichte von 50 bis 200 ng pro mg Haut Gewebe19,20,21. Vergleich mit dem 1.43 ng RNA, die aus der absorbierenden Microbiopsy im Durchschnitt (Abbildung 3), das Gewicht des aufgenommenen Hautgewebe zurückgewonnen wurde voraussichtlich Palette von 0,29-115 µg basierend auf dem gleichen Verhältnis der RNA-Gewebe aus Haut Punch Biopsie Studien.
Dieses Protokoll ist nicht ohne Fallstricke, obwohl einige der Probleme leicht überwunden werden kann. Zum Beispiel schlug die RNA-Extraktion-Daten eine erhebliche Variation auch mit der 10-s Haltezeit (Abbildung 3). Um das Problem zu beheben, ist eine mögliche Lösung optimieren das Anwendungsprotokoll. Parameter wie Kraft auf die Haut aufgetragen und Haltezeit sollte getestet und optimiert, um die Schwankungen der Probengewinnung zu reduzieren. Das mögliche Problem ist die Entfernung des Microbiopsy aus dem Gerät, das die Probe Integrität und Erholung auswirken könnten. Zwar die Microbiopsy für die RNA-Extraktion entfernen einen effektiven Ansatz, das gesamte Verfahren ist langwierig und Verunreinigungen in den Prozess die Probe ausgesetzt sein könnte. Daher ist die Änderung des Protokolls Probe Verarbeitung sehr erwünscht, um Probe Integrität gewährleisten und verhindern, dass Probenverlust.
Nachdem die oben genannten zwei Probleme behoben sind, wird erwartet, dass das Gerät ein Standardwerkzeug für die klinische Forschung. Es ist wichtig zu beachten, dass das Gerät gleichzeitig Haut und Blut Probe erfasst und dies in Betracht gezogen werden, sollte bei der Analyse von Genexpressionsdaten. Zusammenfassend, beschreibt dieses Protokoll die Details des absorbierenden Microbiopsy als einfach und minimal-invasive Werkzeug für kombinierte Haut und Blutabnahme und die anschließende Probe Verarbeitung für relative gen Expression profiling durchführen.
The authors have nothing to disclose.
Wir würden gerne NHMRC Stipendien APP1109749 und APP1111216, Universität von Queensland Centennial Stipendium und International Postgraduate Research Scholarship anerkennen.
Absorbent microbiopsy fabrication and sampling | |||
Absorbent Microbiopsy | Trajan Scientific and Medical | N/A | https://www.trajanscimed.com/ |
Whatman filter paper, Grade 1 | Sigma Aldrich | WHA1001325 | N/A |
RNA extraction | |||
PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher | KIT0214 | Including all buffer soltuions described in protocol |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977015 | Improving RNA quality in RNA elution step |
2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile | Thomas Scientific | 1226S74 | N/A |
Microcentrifuge 5415R | Eppendorf | Z605212 | N/A |
cDNA synthesis | |||
SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline | BIO-65053 | N/A |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | N/A |
qPCR reaction and data analysis | |||
SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-94005 | Including reagents described in qPCR reaction steps |
MicroAmp Optical Adhesive Film | ThermoFisher Scinentific | 4311971 | N/A |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate | ThermoFisher Scinentific | 4343370 | N/A |
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher Scinentific | 4485694 | N/A |
GraphPad Prism (v6.04) | GraphPad | N/A; Windows version | Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps |
PCR primers | |||
RPLP0 F | Sigma Aldrich | N/A | ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC |
RPLP0 R | Sigma Aldrich | N/A | CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG |
TYR F | Sigma Aldrich | N/A | TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA |
TYR R | Sigma Aldrich | N/A | AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC |
KRT14 F | Sigma Aldrich | N/A | CCT CCT CCC AGT TCT CCT |
KRT14 R | Sigma Aldrich | N/A | ACA CCA CCT TGC CAT CG |
CD3E F | Sigma Aldrich | N/A | CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG |
CD3E R | Sigma Aldrich | N/A | GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG |
CD19 F | Sigma Aldrich | N/A | TTC TGC CTG TGT TCC CTT G |
CD19 R | Sigma Aldrich | N/A | GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T |