この記事では、吸収性の microbiopsy テクニックを実行する方法と、皮膚や血液のシンプルで同時サンプリングのための RNA の抽出のサンプルを使用して、低侵襲な方法を示しています。
従来の皮膚生検は、化粧品に敏感な部分やその侵襲による小児のアプリケーションを含む臨床研究を制限します。ここでは、皮膚や血液の混合物の低侵襲のサンプリングのため吸収性マイクロニードル ベースのデバイス、吸収性の microbiopsy を使用するためのプロトコルについて述べる。私たちの目標は、臨床研究、皮膚疾患と臨床研究参加者のリスクを減らすのためのバイオ マーカーの確立で急速な進歩を促進するためにです。従来皮膚生検する方法と対照をなして吸収 microbiopsy 数秒以内に実行することができます、そのシンプルなデザインのための集中的な訓練を必要としません。本報告では読み込みとボランティア上のアプリケーションを含む、吸収性の microbiopsy の使用をについて説明します。その後、吸収のサンプルからの RNA を隔離する方法を示します。最後に、我々 は、定量的逆転写 PCR (RT qPCR) 血液 (CD3EとCD19) と皮 (KRT14やTYR) の mRNA 発現量を定量化するための使用を示します。述べる方法は、棚キットおよび試薬を利用します。このプロトコルでは、皮膚と同じ吸収 microbiopsy マトリックス内の血の同時サンプリング低侵襲アプローチを提供しています。我々 は、皮膚科学研究へのこのアプローチを支持する人間の倫理委員会、医師やボランティアを発見しました。
皮膚生検は皮膚をサンプリングするため皮膚科で最も重要なテクニックの 1 つと皮膚病の病理組織学的評価を通じてその後診断です。生検法には、ブレードやパンチ生検を使用して試験1の患者の皮膚に疑わしい病変を削除する専門医療機関にはが含まれます。テクニックは効果的な非常に侵略的、終点は通常分子生物学技術2,3を含む臨床研究の制限します。皮膚疾患の分子生物学的解析には、病理組織学的解析ができないし、こうして促進薬剤探索と疾患診断4,5非常に特定の生物学的情報を提供する可能性があります。その上、最も分子技術のサンプル需要は比較的小さい動物の使用の削減につながる可能性がありますと複製の大きい数を許可します。したがって、ある明確な臨床研究における分子解析を可能にし参加者のリスクを下げる方法の必要があります。
フィールドでそのような必要性に対処するため当社グループは、新規マイクロニードル ベースの診断プラットフォーム、シンプルで低侵襲の方法6の血液と混合肌の小さな量のコレクションを可能にする吸収性の microbiopsy を開発しました。この文書の目的は、臨床研究における RNA の抽出による分子の分析を容易にするツールをサンプリングとして吸水性 microbiopsy を記述するためです。
以前は、microbiopsy、皮膚組織7の小さな断片を抽出する 3 層鋼プレート デザイン製マイクロニードルから成っている皮膚 microbiopsy の最初のバージョンを説明しました。このデバイスの目新しさは、効率的な組織抽出3を許可するマイクロニードルから複数の接触ポイントから来ています。対照的に、円形皮膚生検は 1 つだけの接触ポイントを提供し、単にいくつかのケースで任意のサンプルをキャプチャすることがなく肌を涙します。皮膚 microbiopsy に基づいて、我々 は最近血液と皮膚機能のサンプリングを持つ吸水性 microbiopsy を開発しました。デバイスは、最近の疫学的研究6で資源に乏しい地域で使用可能であること示されています。
その単純な設計のため吸水性 microbiopsy は、ほんの数秒で実行でき、広範なトレーニングを必要としません。また、局所麻酔薬が必要でない、アプリケーション サイトは瘢痕を発生しません。存在のプロトコルは、分子生物学的解析の対象となる皮膚のデータを取得するトレーニング関連のサンプリングなしの研究者や医療従事者をできます。我々 は将来的に皮膚研究のルーチンになる特定のデバイスを期待します。
Microbiopsy は、分子診断技術6,8,9,10, ヒトパピ ローマ ウイルス DNA の検出、このプロトコルなどを含んだ他の皮膚病の研究で報告されているが吸収性の microbiopsy のサンプルの抽出と処理技術の詳細を説明する最初のです。さらに、これは皮膚と microbiopsy サンプルの血液細胞の相対的な遺伝子発現プロファイルを記述する最初のレポートです。
これらの結果を示す分子特性評価のための皮膚や血液の混合物のシンプルで低侵襲のサンプリングのためのツールとして吸水性 microbiopsy が使えます。私達のプロトコルに従ってデバイス アプリケーションは RNA 量別のアプリケーション プロトコル (図 3) と回復の違いが示すように、信頼性の高い結果を得るために不可欠です。サンプルが抽出される RNA の抽出のためのステップの処理以降のサンプル高確立したプロトコル15,16に似ていますその上吸収 microbiopsy に変更される RNA の抽出の最初の手順から別のキーの変更下流のアプリケーションの結果を改善するために水の RNase フリーの使用であります。また、この研究で使用される参照の遺伝子がRPLP0であることを言及する価値があります。RPLP0関数が別の細胞と組織の種類17の知られているは、非黒色腫皮膚癌および前癌病変18で使用するための適切な参照の遺伝子として報告されています。
デバイスの主要な限界の 1 つは、時間がかかり、潜在的、特に RNA のような敏感なサンプル サンプルの損失のチャンスを増加するデバイスから microbiopsy の除去です。それにもかかわらず、予冷却 2 mL 遠心チューブ、ドライアイスなどの滅菌処理のツールによる問題を克服できます。
吸収性の microbiopsy の使用は簡単、集中的な訓練を必要としません。従来の生検は、microbiopsy があれば RT qPCR などの確立された分子診断技術と分子特性は必要ではありません。さらに定量化し吸水性 microbiopsy のサンプリング能力を発揮、人間の皮膚組織からの RNA 抽出を含んだ前の文献を調べた。典型的な 3.0 または 4.0 mm の皮膚から、生検をパンチ、3 つの研究は、50 〜 200 抽出した RNA 量を報告している皮膚組織19,20,21mg 当たり ng。1.43 と比較する平均 (図 3)、サンプリングされた皮膚組織の重量で吸収性の microbiopsy から回収された RNA の ng は 0.29 115 範囲と予想皮膚パンチ生検研究から同じ RNA の組織比率に基づいて μ g。
問題の一部は簡単に解決することができますが、このプロトコルは潜在的な落とし穴は、ないわけです。たとえば、RNA 抽出データは、10 の保持時間 (図 3) ともかなりの変化を提案しました。問題を解決するには、1 つの潜在的なソリューションにはアプリケーション プロトコルの最適化が含まれます。力などのパラメーターは、皮膚に適用し、テストおよびサンプル抽出の変動を減らすために最適化時間を保持している必要があります。他の潜在的な問題は、サンプルの整合性と回復に影響を与える可能性がありますデバイスから microbiopsy の除去です。RNA の抽出の microbiopsy を削除することは効果的な方法が、全体の手順は面倒です, とサンプルは、プロセスの汚染にさらされるかもしれない。したがって、サンプル処理プロトコルの変更はサンプルの整合性を確保し、サンプルの損失を防ぐためにすることが望ましい。
上記の 2 つの問題が処理されると、デバイスは臨床研究のための標準的なツールになることが期待されます。デバイスは、同時に皮膚や血液のサンプルをキャプチャし、このする必要があります考慮する遺伝子発現データを分析する際に注意することが重要です。結論としては、このプロトコルは結合された皮膚と採血と相対的な遺伝子発現プロファイルの処理以降のサンプルのための簡単かつ低侵襲ツールとしての吸水性 microbiopsy の実行に関する詳細をについて説明します。
The authors have nothing to disclose.
NHMRC 奨学金 APP1109749 と APP1111216、クイーンズランド大学百周年記念奨学金、国際大学院研究奨学金を認識したいと思います。
Absorbent microbiopsy fabrication and sampling | |||
Absorbent Microbiopsy | Trajan Scientific and Medical | N/A | https://www.trajanscimed.com/ |
Whatman filter paper, Grade 1 | Sigma Aldrich | WHA1001325 | N/A |
RNA extraction | |||
PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher | KIT0214 | Including all buffer soltuions described in protocol |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977015 | Improving RNA quality in RNA elution step |
2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile | Thomas Scientific | 1226S74 | N/A |
Microcentrifuge 5415R | Eppendorf | Z605212 | N/A |
cDNA synthesis | |||
SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline | BIO-65053 | N/A |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | N/A |
qPCR reaction and data analysis | |||
SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-94005 | Including reagents described in qPCR reaction steps |
MicroAmp Optical Adhesive Film | ThermoFisher Scinentific | 4311971 | N/A |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate | ThermoFisher Scinentific | 4343370 | N/A |
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher Scinentific | 4485694 | N/A |
GraphPad Prism (v6.04) | GraphPad | N/A; Windows version | Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps |
PCR primers | |||
RPLP0 F | Sigma Aldrich | N/A | ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC |
RPLP0 R | Sigma Aldrich | N/A | CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG |
TYR F | Sigma Aldrich | N/A | TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA |
TYR R | Sigma Aldrich | N/A | AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC |
KRT14 F | Sigma Aldrich | N/A | CCT CCT CCC AGT TCT CCT |
KRT14 R | Sigma Aldrich | N/A | ACA CCA CCT TGC CAT CG |
CD3E F | Sigma Aldrich | N/A | CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG |
CD3E R | Sigma Aldrich | N/A | GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG |
CD19 F | Sigma Aldrich | N/A | TTC TGC CTG TGT TCC CTT G |
CD19 R | Sigma Aldrich | N/A | GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T |