लसीका Endothelial कोशिकाओं के एक प्रवाह Cytometric विश्लेषण के लिए Murine जिगर के पाचन
Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य वर्णित मार्करों का उपयोग कर जिगर के भीतर लसीका endothelial कोशिका आबादी की पहचान है । हम collagenase चतुर्थ और DNase और ऊतक के एक सज्जन नख़रेबाज़ का उपयोग, प्रवाह cytometry के साथ संयुक्त, लसीका endothelial कोशिकाओं की एक अलग आबादी की पहचान ।
Abstract
जिगर के भीतर, लसीका वाहिकाओं के भीतर पोर्टल त्रय पाया जाता है, और उनके वर्णित समारोह के लिए जिगर से लिम्फ नोड्स जहां सेलुलर मलबे और एंटीजन सर्वेक्षण किया जा सकता है के मध्य द्रव को दूर करने के लिए है । हम बहुत समझ कैसे लसीका vasculature सूजन में शामिल हो सकता है और जिगर के भीतर प्रतिरक्षा कोशिका समारोह में रुचि रखते हैं । हालांकि, बहुत कम जिगर या विशिष्ट मार्करों कि सेल के आधार पर एक प्रति पर जिगर LECs का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता से लसीका endothelial कोशिकाओं (LECs) के अलगाव के लिए पाचन प्रोटोकॉल स्थापित प्रकाशित किया गया है । इसलिए, हम पाचन और जिगर के दाग के लिए एक विधि को अनुकूलित करने के लिए जिगर में LEC जनसंख्या का मूल्यांकन । हमें विश्वास है कि यहां उल्लिखित विधि जिगर से LECs की पहचान और अलगाव के लिए उपयोगी हो जाएगा और कैसे LECs जिगर microenvironment का जवाब के बारे में हमारी समझ को मजबूत करेगा ।
Introduction
जिगर में लसीका वाहिकाओं और LECs की भूमिका अच्छी तरह से समझ में नहीं है । जबकि लसीका वाहिकाओं पोर्टल के भीतर पाया जिगर1 के त्रय और2रोग के दौरान विस्तार, बहुत कम समारोह और जिगर के भीतर LECs के phenotype के बारे में समझ में आता है । मार्करों कि LECs3पर मुख्य रूप से पाए जाते है की खोज के साथ, homeostasis और रोग में विभिंन ऊतक niches के भीतर इन कोशिकाओं के महत्व को हमारी समझ में एक महत्वपूर्ण अंतर भरना होगा । LECs लिम्फ नोड में परिधीय सहिष्णुता को बनाए रखने में और मेटास्टेटिक ट्यूमर में एक प्रमुख भूमिका है टी कोशिकाओं के साथ सीधे बातचीत द्वारा4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. लिम्फ नोड में LECs प्रवासी वृक्ष कोशिकाओं के साथ अपनी बातचीत के माध्यम से सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा को बढ़ावा देने के कर सकते हैं14,15,16. इसलिए, LECs के लिए कई भूमिकाएं है जो ऊतकों और बातचीत जिसमें वे मौजूद है के लिए विशिष्ट हो सकता है । हालांकि, बहुत कम कैसे LECs ऊतक में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ बातचीत या कैसे अलग अंग प्रणालियों में LECs समारोह के बारे में समझा जाता है; इस प्रकार, जिगर या अंय अंगों के भीतर एक प्रति कोशिका के आधार पर LECs का मूल्यांकन कैसे LECs कार्यक्रम ऊतक विशिष्ट प्रतिरक्षा में प्रगति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । जबकि अधिक साहित्य है कि जिगर में LECs पर ध्यान केंद्रित करने के लिए सूक्ष्म का उपयोग करता है LECs कल्पना एक या दो मार्करों और आकृति विज्ञान17का उपयोग कर, बहुत कम किया गया है विशेष रूप से सेल आधार द्वारा एक सेल पर LECs का मूल्यांकन प्रवाह cytometry का उपयोग कर, हालांकि एक अध्ययन जिगर sinusoidal endothelial कोशिकाओं (LSECs) और LECs18के बीच मतभेद का मूल्यांकन किया । प्रवाह cytometry द्वारा जिगर में LEC आबादी का विश्लेषण करने में सक्षम होने के नाते सामान्य homeostasis या रोग के दौरान LEC phenotype के में गहराई से अध्ययन के लिए अनुमति देता है.
प्रवाह cytometry द्वारा LECs का मूल्यांकन करने के लिए, एकाधिक सतह मार्कर की आवश्यकता है । आमतौर पर, LECs prospero-संबंधित homeobox 1 (प्रोक्स-1), लसीका पोत endothelial hyaluronan रिसेप्टर 1 (LYVE1) या संवहनी endothelial वृद्धि कारक रिसेप्टर 3 (VEGFR3) माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर की अभिव्यक्ति द्वारा कल्पना कर रहे हैं । हालांकि, जिगर में, इन मार्करों की अभिव्यक्ति LECs तक ही सीमित नहीं है । प्रोक्स-1 व्यापक रूप से हेपैटोसाइट्स द्वारा जिगर के विकास के दौरान व्यक्त की है, पुनर्जनन, और चोट19, और LYVE1 और VEGFR3 जिगर sinusoidal endothelial कोशिकाओं18द्वारा व्यक्त कर रहे हैं । लिम्फ नोड में, LECs विभेदक (सीडी) CD45-, CD31 +, और podoplanin + (PDPN)16के समूहों के रूप में प्रवाह cytometry का उपयोग कर की पहचान कर रहे हैं । हालांकि, इस दृष्टिकोण भी CD45-CD31 के बाद से जिगर में LECs को अलग करने के लिए कम है + कोशिकाओं endothelial कोशिकाओं पर कब्जा होगा, और जिगर में संवहनी endothelial कोशिकाओं की प्रमुख आबादी LSECs हैं. इस प्रकार, अंय मार्करों प्रचुर LSEC आबादी से दुर्लभ LEC जनसंख्या भेद करने की जरूरत है । दोनों CD16 32/(परिपक्व LSECs18द्वारा व्यक्त) और CD146 (एक आम संवहनी endothelial सेल मार्कर है कि जिगर predominately जिगर के भीतर व्यक्त sinusoids sinusoidal कोशिकाओं20 के साथ थोड़ा लसीका द्वारा कोई अभिव्यक्ति के लिए endothelial है endothelial सेल21) परीक्षार्थी मार्कर थे ।
इसलिए, हम अलग और ऊपर मार्करों का उपयोग कर जिगर में LECs visualizing के लिए एक विधि अनुकूलित, CD45, CD31, CD146, CD16/32, और PDPN प्रवाह cytometry के लिए । हम एक एकल सेल निलंबन में collagenase IV, DNase 1, और जिगर ऊतक पाचन के लिए यांत्रिक जुदाई के उपयोग का वर्णन । हम भी गैर के अलगाव के लिए iodixanol घनत्व ढाल के उपयोग का वर्णन-parenchymal कोशिकाओं (एनपीसी) और सेलुलर मलबे को खत्म करने के लिए । अंत में, एकाधिक मार्कर का उपयोग कर, हम इष्टतम प्रवाह cytometry गेटिंग रणनीति के लिए प्रमुख मार्कर के रूप में PDPN के साथ जिगर से LECs की पहचान निर्धारित करते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रतिरक्षा homeostasis और विनियमन में LECs का समग्र महत्व हाल ही में25प्रकाश में आया है । प्रकाशित लसीका साहित्य के अधिकांश त्वचा और लिम्फ नोड्स पर केंद्रित है; हालांकि, लसीका पूरे शरीर में पाए जाते है और…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस परियोजना के मौद्रिक समर्थन के लिए सैनिक और जिगर जंमजात प्रतिरक्षा कार्यक्रमों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । B.A.J.T. भी R01 AI121209 द्वारा वित्तपोषित है.
Materials
| Clicks/EHAA media | Irvine Scientific | 9195 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical corporation | LS004188 | |
| DNase I | Worthington Biochemical corporation | LS002145 | Deoxyribonuclease 1 |
| OptiPrep | Sigma Aldrich | D1556 | Density Gradient Medium |
| V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1 | BD biosciences | 562232 | |
| FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1 | Biolegend | 134706 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102422 | |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31( clone 390) | Biolegend | 102420 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1) | Biolegend | 127410 | Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN) |
| APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11 | Biolegend | 103138 | |
| FITC anti mouse CD16/32 (clone 93) | Biolegend | 101306 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32( clone 93) | Biolegend | 101324 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| ghost red 780 viability dye | TONBO biosceinces | 3-0865-T100 | |
| APC syrian hamster IgG (clone SHG-1) | Biolegened | 402102 | |
| PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) | Biolegend | 400531 | |
| FITC rat IgG2 (clone eBR2a) | ebioscience | 1-4321-80 | |
| Anti mouse LYVE1 (clone 223322) | R&D systems | FAB2125A | |
| anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078) | abcam | ab181598 | |
| anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1) | Bio-rad | MCA497 | |
| BSA (fraction V) | Fischer | BP1600-100 | Bovine Serum Albumin (BSA) |
| Goat serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| EDTA | VWR | E177 | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer |
| Ammonium Chloride | Fischer | A687-500 | for RBC Lysis buffer |
| Potassium Bicarbonate | Fischer | P184-500 | for RBC Lysis buffer |
| Scalpel | Feather | 2975#21 | |
| 100um cell strainer | Fischer | 22363549 | |
| 2.4G2 | in house/ATCC | ATCC HB-197 | FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11550 | |
| 96 well plate | Corning | 3788 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| 50 ml conical | Truline | TR2004 | |
| 15 ml conical | Falcon | 352196 | |
| 1 ml Pipete tip | USA scientific | 1111-2721 | |
| 200 µl pipete tip | USA scientific | 1110-1700 | |
| 10 µl pipete tip | USA scientific | 1111-3700 | |
| seriological 10ml pipete | greiner bio-one | 607107 | |
| seriological 5ml pipete | greiner bio-one | 606107 | |
| Cell incubator | Fischer | Heracell 160i | |
| BD FacsCanto II flow cytometer | BD biosciences | ||
| Clinical Centrifuge | Beckman coulter | model X-14R |
References
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