El objetivo de este protocolo es identificar las poblaciones de células endoteliales linfáticas dentro del hígado usando marcadores descritos. Utilizamos colagenasa IV y DNasa y un picado suave del tejido, combinado con citometría de flujo, para identificar una población diferente de células endoteliales linfáticas.
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Artículo de método
Digestión del hígado murino para el análisis cytometric del flujo de las células endoteliales linfáticas
En este artículo
Resumen
Resumen
En el hígado, los vasos linfáticos se encuentran dentro de la tríada portal, y su función es eliminar líquido intersticial desde el hígado a los ganglios linfáticos donde detritos celulares y antígenos pueden ser examinados. Estamos muy interesados en la comprensión de cómo puede participar la vasculatura linfática en inflamación y función de las células inmunes en el hígado. Sin embargo, muy poco ha publicado establecer protocolos de digestión para el aislamiento de las células endoteliales linfáticas (LECs) desde el hígado o los marcadores específicos que pueden utilizarse para evaluar hígado LECs de forma por la célula. Por lo tanto, hemos optimizado un método para la digestión y la coloración del hígado con el fin de evaluar la población de la LEC en el hígado. Estamos seguros de que el método descrito aquí será útil para la identificación y aislamiento de LECs de hígado y fortalecerá nuestra comprensión de cómo LECs responden al microambiente hepático.
Introducción
No se comprende bien el papel de los vasos linfáticos y LECs en el hígado. Mientras que los vasos linfáticos se encuentran dentro de la tríada portal del hígado1 y durante la enfermedad2, muy poco se entiende sobre la función y el fenotipo de LECs dentro del hígado. Con el descubrimiento de marcadores que se encuentran principalmente en el LECs3, la importancia de estas células dentro de nichos de diferentes tejidos en homeostasis y enfermedad llenará un vacío importante en nuestro entendimiento. LECs tienen un papel importante en mantener la tolerancia periférica en los ganglios linfáticos y en l....
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Protocolo
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) del Universidad de Colorado Anschutz Medical Campus.
1. preparación de los materiales
- Hacer una solución de 5 mg/mL de DNasa I en tampón fosfato salino (PBS).
- Hacer una mezcla de digestión mediante la adición de 5.000 U/mL de colagenasa IV a los medios de comunicación EHAA haga clic en el.
- Caliente la mezcla de digestión a 37 ° C por 30 min antes de usar.
- Hacer un buffer de aislamiento añadiendo 4.8% albúmina de suero bovino (BSA) y 2 mM....
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Resultados
Estudios análisis de hígado linfáticos han utilizado principalmente inmunohistoquímica para cuantificar la frecuencia y el diámetro de los vasos linfáticos en el hígado. Sin embargo, este método no permite para la evaluación de LECs en forma de celda por celda o para la expresión de múltiples marcadores de citoquinas, quimioquinas y factores de transcripción. Por lo tanto, preguntamos si hígado LECs puede ser aislados del hígado y evaluado mediante citometría de flujo. Trabajo previo aisl.......
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Discusión
La importancia de LECs en homeostasis inmune y regulación ha llegado recientemente a luz25. Gran parte de la bibliografía linfática se centra en piel y ganglios linfáticos; sin embargo, linfáticos se encuentran en todo el cuerpo26 y, por lo tanto, es necesaria la comprensión de su importancia en diversos órganos. A continuación os mostramos un método en el que se pueden estudiar LECs en el hígado en forma de célula por célula para comprender mejor su expresión concurrente d.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a la GI y programas inmune innata de hígado para el apoyo financiero de este proyecto. B.A.J.T. es también financiado por AI121209 R01.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Clics/medios EHAA | Irvine Scientific | 9195 | |
| Colagenasa IV | Worthington Biochemical corporation | LS004188 | |
| DNasa I | Worthington Biochemical corporation | LS002145 | Desoxirribonucleasa 1 |
| OptiPrep | Sigma Aldrich | D1556 | Medio de gradiente de densidad |
| V450 anti ratón CD146 (clon ME-9F1) | BD biociencias | 562232 | |
| FITC anti ratón CD146 (clon ME-9F1) | Biolegend | 134706 | Isotiocianato de fluoresceína (FITC) |
| Pacific Blue anti ratón CD31(clon 390) | Biolegend | 102422 | |
| PerCp/Cy5.5 anti ratón CD31 (clon 390) | Biolegend | 102420 | Proteínas de peridina-clorofila-cianina 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| APC anti ratón PDPN (clon 8.1.1) | Biolegend | 127410 | Aloficocianina (APC), podoplanina (PDPN) |
| APC/Cy7 anti ratón CD45 (clon 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| Brilliant Violet 510 anti ratón CD45 (clon 30-F11) | Biolegend | 103138 | |
| FITC anti ratón CD16/32 (clon 93) | Biolegend | 101306 | Isotiocianato de fluoresceína (FITC) |
| PerCp/Cy5.5 anti ratón CD16/32 (clon 93) | Biolegend | 101324 | Proteínas de peridinina-clorofila-Cianina 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| rojo fantasma 780 colorante de viabilidad | TONBO biosceinces | 3-0865-T100 | |
| APC hámster sirio IgG (clon SHG-1) | Biolegened | 402102 | |
| PerCp/Cy5.5 rata IgG2a (clon RTK2758) | Biolegend | 400531 | |
| FITC rata IgG2 (clon eBR2a) | ebioscience | 1-4321-80 | |
| Anti ratón LYVE1 (clon 223322) | R& D systems | FAB2125A | |
| anti-ratón Citoqueratina (clon EPR17078) | abcam | ab181598 | |
| anti-ratón F4/80 (clon Cl:A3-1) | Bio-rad | MCA497 | |
| BSA (fracción V) | Fischer | BP1600-100 | Albúmina sérica bovina (BSA) |
| Suero de cabra | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Suero de burro | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| EDTA | VWR | E177 | Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) -para tampón de lisis de glóbulos rojos |
| Cloruro de amonio | Fischer | A687-500 | para glóbulos rojos Tampón de lisis |
| Bicarbonato de potasio | Fischer | P184-500 | para glóbulos rojos Tampón de lisis |
| Bisturí Feather | 2975#21 | ||
| 100 μ Filtro de células m | Fischer | 22363549 | |
| 2.4G2 | en casa/ATCC | ATCC HB-197 | Bloque FC para inhibir la unión inespecífica a las células Fc gamma + -hecho de hibridoma |
| solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Hanks Solución salina equilibrada (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Atlanta biológicos | S11550 | |
| placa de 96 pocillos | Corning | 3788 | |
| placa de 6 pocillos | Corning | 3506 | |
| 50 mL cónica | Truline | TR2004 | |
| 15 mL cónica | Falcon | 352196 | |
| 1 mL Punta de pipeta | USA scientific | 1111-2721 | |
| 200 µ L punta de pipeta | USA scientific | 1110-1700 | |
| 10 µ Punta de pipeta L | USA scientific | 1111-3700 | |
| seriológico 10 mL pipeta | Greiner Bio-One | 607107 | |
| seriológico 5 mL | pipeta Greiner Bio-One | 606107 | |
| Incubadora de células | Fischer | Heracell 160i | |
| BD FacsCanto II citómetro de flujo | BD biosciences | ||
| centrífuga clínica | Beckman reja | modelo X-14R |
Referencias
- Tanaka, M., Iwakiri, Y. Lymphatics in the liver. Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).
- Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis. The ....
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Reimpresiones y permisos
