Digestión del hígado murino para el análisis cytometric del flujo de las células endoteliales linfáticas
Summary
El objetivo de este protocolo es identificar las poblaciones de células endoteliales linfáticas dentro del hígado usando marcadores descritos. Utilizamos colagenasa IV y DNasa y un picado suave del tejido, combinado con citometría de flujo, para identificar una población diferente de células endoteliales linfáticas.
Abstract
En el hígado, los vasos linfáticos se encuentran dentro de la tríada portal, y su función es eliminar líquido intersticial desde el hígado a los ganglios linfáticos donde detritos celulares y antígenos pueden ser examinados. Estamos muy interesados en la comprensión de cómo puede participar la vasculatura linfática en inflamación y función de las células inmunes en el hígado. Sin embargo, muy poco ha publicado establecer protocolos de digestión para el aislamiento de las células endoteliales linfáticas (LECs) desde el hígado o los marcadores específicos que pueden utilizarse para evaluar hígado LECs de forma por la célula. Por lo tanto, hemos optimizado un método para la digestión y la coloración del hígado con el fin de evaluar la población de la LEC en el hígado. Estamos seguros de que el método descrito aquí será útil para la identificación y aislamiento de LECs de hígado y fortalecerá nuestra comprensión de cómo LECs responden al microambiente hepático.
Introduction
No se comprende bien el papel de los vasos linfáticos y LECs en el hígado. Mientras que los vasos linfáticos se encuentran dentro de la tríada portal del hígado1 y durante la enfermedad2, muy poco se entiende sobre la función y el fenotipo de LECs dentro del hígado. Con el descubrimiento de marcadores que se encuentran principalmente en el LECs3, la importancia de estas células dentro de nichos de diferentes tejidos en homeostasis y enfermedad llenará un vacío importante en nuestro entendimiento. LECs tienen un papel importante en mantener la tolerancia periférica en los ganglios linfáticos y en los tumores metastáticos interactuando directamente con T las células4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. LECs en los ganglios linfáticos pueden promover inmunidad protectora a través de sus interacciones con las células dendríticas migratorias14,15,16. Por lo tanto, hay múltiples funciones de LECs que pueden ser específicos de los tejidos y las interacciones en que están presentes. Sin embargo, muy poco se entiende sobre cómo interactúan con las células inmunes en el tejido los LECs o funcionan de LECs en diferentes órganos; por lo tanto, evaluar LECs en una base por células en el hígado u otros órganos puede conducir a avances en cómo LECs programa inmunidad específica de tejido. Mientras que mucha de la literatura que se centra en el LECs en el hígado utiliza la microscopia visualizar LECs con uno o dos marcadores y morfología17, muy poco se ha hecho para evaluar específicamente LECs en una base de la célula por célula mediante citometría de flujo, aunque un estudio evaluar las diferencias entre las células endoteliales sinusoidales hepáticas (LSECs) y LECs18. Poder analizar las poblaciones de la LEC en el hígado mediante citometría de flujo permite el estudio en profundidad del fenotipo de la LEC durante la homeostasis normal o enfermedad.
Para evaluar el LECs por citometría de flujo, se necesitan múltiples marcadores de superficie. Por lo general, LECs son visualizados por la expresión de homeobox relacionado con prospero 1 (Prox 1), receptor del recipiente linfático hyaluronan endotelial 1 (LYVE1) o factor de crecimiento endotelial vascular del receptor 3 (VEGFR3) mediante microscopía. Sin embargo, en el hígado, la expresión de estos marcadores no se limita a LECs. Prox-1 se expresa ampliamente por los hepatocitos durante el desarrollo del hígado, regeneración y lesiones19, y LYVE1 y VEGFR3 son expresados por las células endoteliales sinusoidales del hígado18. En los ganglios linfáticos, el LECs se identifican mediante citometría de flujo como racimos de diferenciación (CD) CD45 – CD31 + y podoplanin + (PDPN)16. Sin embargo, este enfoque es también mínimo para aislar LECs en el hígado, ya que las células CD45 – CD31 + capturará las células endoteliales, y la población predominante de las células endoteliales vasculares en el hígado es LSECs. Así, se necesitan otros marcadores para distinguir la rara población de LEC de la abundante población de LSEC. CD16/32 (expresado por maduros LSECs18) y CD146 (un célula endotelial vascular marcador común que es predominantemente expresada dentro de los sinusoides del hígado por las células endoteliales sinusoidales del hígado20 con poca o ninguna expresión por linfático las células endoteliales21) fueron marcadores de candidato.
Por lo tanto, hemos optimizado un método para aislar y visualizar LECs en el hígado utilizando los anteriores marcadores, CD45, CD31, CD146, CD16/32 y PDPN para citometría de flujo. Describimos el uso de colagenasa IV, DNasa 1 y separación mecánica para la digestión del tejido del hígado en una suspensión unicelular. También describimos el uso de iodixanol gradiente de densidad para el aislamiento de células no parenquimatosas (NPC) y para eliminar desechos celulares. Por último, uso de marcadores múltiples, determinar la estrategia bloquea de citometría de flujo óptimo para identificar LECs del hígado con PDPN como el marcador predominante.
Protocol
Representative Results
Discussion
La importancia de LECs en homeostasis inmune y regulación ha llegado recientemente a luz25. Gran parte de la bibliografía linfática se centra en piel y ganglios linfáticos; sin embargo, linfáticos se encuentran en todo el cuerpo26 y, por lo tanto, es necesaria la comprensión de su importancia en diversos órganos. A continuación os mostramos un método en el que se pueden estudiar LECs en el hígado en forma de célula por célula para comprender mejor su expresión …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a la GI y programas inmune innata de hígado para el apoyo financiero de este proyecto. B.A.J.T. es también financiado por AI121209 R01.
Materials
| Clicks/EHAA media | Irvine Scientific | 9195 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical corporation | LS004188 | |
| DNase I | Worthington Biochemical corporation | LS002145 | Deoxyribonuclease 1 |
| OptiPrep | Sigma Aldrich | D1556 | Density Gradient Medium |
| V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1 | BD biosciences | 562232 | |
| FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1 | Biolegend | 134706 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102422 | |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31( clone 390) | Biolegend | 102420 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1) | Biolegend | 127410 | Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN) |
| APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11 | Biolegend | 103138 | |
| FITC anti mouse CD16/32 (clone 93) | Biolegend | 101306 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32( clone 93) | Biolegend | 101324 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| ghost red 780 viability dye | TONBO biosceinces | 3-0865-T100 | |
| APC syrian hamster IgG (clone SHG-1) | Biolegened | 402102 | |
| PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) | Biolegend | 400531 | |
| FITC rat IgG2 (clone eBR2a) | ebioscience | 1-4321-80 | |
| Anti mouse LYVE1 (clone 223322) | R&D systems | FAB2125A | |
| anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078) | abcam | ab181598 | |
| anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1) | Bio-rad | MCA497 | |
| BSA (fraction V) | Fischer | BP1600-100 | Bovine Serum Albumin (BSA) |
| Goat serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| EDTA | VWR | E177 | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer |
| Ammonium Chloride | Fischer | A687-500 | for RBC Lysis buffer |
| Potassium Bicarbonate | Fischer | P184-500 | for RBC Lysis buffer |
| Scalpel | Feather | 2975#21 | |
| 100um cell strainer | Fischer | 22363549 | |
| 2.4G2 | in house/ATCC | ATCC HB-197 | FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11550 | |
| 96 well plate | Corning | 3788 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| 50 ml conical | Truline | TR2004 | |
| 15 ml conical | Falcon | 352196 | |
| 1 ml Pipete tip | USA scientific | 1111-2721 | |
| 200 µl pipete tip | USA scientific | 1110-1700 | |
| 10 µl pipete tip | USA scientific | 1111-3700 | |
| seriological 10ml pipete | greiner bio-one | 607107 | |
| seriological 5ml pipete | greiner bio-one | 606107 | |
| Cell incubator | Fischer | Heracell 160i | |
| BD FacsCanto II flow cytometer | BD biosciences | ||
| Clinical Centrifuge | Beckman coulter | model X-14R |
References
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