Digestione del fegato murino per un'analisi citofluorimetrica delle cellule endoteliali linfatiche
Summary
L’obiettivo del presente protocollo è quello di identificare popolazioni di cellule endoteliali linfatiche all’interno del fegato usando gli indicatori descritti. Utilizziamo collagenasi IV e DNasi e una delicata macinazione del tessuto, combinato con citometria a flusso, per identificare una popolazione distinta di cellule endoteliali linfatiche.
Abstract
All’interno del fegato, i vasi linfatici si trovano all’interno della triade portale e loro funzione descritta è per rimuovere il liquido interstiziale dal fegato ai linfonodi dove possono esaminarsi gli antigeni e detriti cellulari. Siamo molto interessati a capire come il sistema vascolare linfatico potrebbe essere coinvolti nell’infiammazione e nella funzione delle cellule immuni all’interno del fegato. Tuttavia, molto poco è stato pubblicato che stabilisce protocolli di digestione per l’isolamento di cellule endoteliali linfatiche (LECs) dal fegato o marcatori specifici che possono essere utilizzati per valutare il fegato LECs su base per cella. Di conseguenza, abbiamo ottimizzato un metodo per la digestione e la macchiatura del fegato al fine di valutare la popolazione di LEC nel fegato. Siamo sicuri che il metodo descritto qui sarà utile per l’identificazione e l’isolamento di LECs dal fegato e rafforzerà la nostra comprensione di come LECs rispondere il microambiente del fegato.
Introduction
Il ruolo dei vasi linfatici e LECs nel fegato non è ben compreso. Mentre i vasi linfatici si trovano all’interno della triade portale del fegato1 ed espandono durante la malattia2, molto poco è capito per quanto riguarda la funzione e il fenotipo di LECs all’interno del fegato. Con la scoperta degli indicatori che si trovano principalmente il LECs3, l’importanza di queste cellule all’interno di nicchie differenti del tessuto nell’omeostasi e nella malattia riempirà una notevole lacuna nella nostra comprensione. LECs hanno un ruolo importante nel mantenimento della tolleranza periferica nel linfonodo ed in tumori metastatici interagendo direttamente con T cellule4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. LECs nel linfonodo può promuovere l’immunità protettiva attraverso le loro interazioni con le cellule dendritiche migratori14,15,16. Di conseguenza, non ci sono più ruoli per LECs che possono essere specifici per i tessuti e le interazioni in cui sono presenti. Tuttavia, molto poco è capito circa come LECs interagiscono con le cellule immunitarie nel tessuto o funzionamento di LECs in sistemi differenti dell’organo; quindi, valutando LECs su base per cella all’interno del fegato o altri organi può portare a progressi nel come LECs programma immunità tessuto-specifica. Mentre gran parte della letteratura che si concentra sulle LEC nel fegato utilizza la microscopia per visualizzare LECs utilizzando uno o due marcatori e morfologia17, molto poco è stato fatto per valutare specificamente LECs su base dalla cella mediante citometria a flusso, anche se uno studio ha fatto valutare le differenze tra le cellule endoteliali sinusoidali del fegato (LSECs) e LECs18. Essendo in grado di analizzare popolazioni LEC nel fegato tramite flusso cytometry consente lo studio approfondito del fenotipo LEC durante la normale omeostasi o malattia.
Per valutare il LECs mediante citometria a flusso, sono necessari più marcatori di superficie. In genere, LECs sono visualizzati dall’espressione di prospero-correlati homeobox 1 (Prox-1), ricevitore 1 (LYVE1) di hyaluronan endoteliale del vaso linfatico o del ricevitore di fattore di crescita endoteliale vascolare 3 (VEGFR3) usando la microscopia. Tuttavia, nel fegato, l’espressione di questi indicatori non è limitato al LECs. Prox-1 è ampiamente espressa dagli epatociti durante lo sviluppo del fegato, rigenerazione e lesioni19, e LYVE1 e VEGFR3 sono espresse da cellule endoteliali sinusoidali epatiche18. Nel linfonodo, LECs sono identificati mediante citometria a flusso come cluster di differenziazione (CD) CD45-, CD31 + e podoplanin + (PDPN)16. Tuttavia, questo approccio è troppo minimal per isolare LECs nel fegato, poiché le cellule CD45 – CD31 + catturerà le cellule endoteliali, e la popolazione predominante delle cellule endoteliali vascolari nel fegato è LSECs. Così, altri indicatori sono necessari per distinguere la popolazione di LEC rara da abbondante popolazione di LSEC. CD16/32 (espresso da maturo LSECs18) sia CD146 (un cellula endoteliale vascolare marcatore comune che è prevalentemente espresso entro i sinusoids del fegato da cellule endoteliali sinusoidali epatiche20 con poca o nessuna espressione di linfatico cellule endoteliali21) erano marcatori candidati.
Di conseguenza, abbiamo ottimizzato un metodo per isolare e visualizzazione LECs nel fegato utilizzando tali marcatori, CD45, CD31, CD146, CD16/32 e linfatico per citometria a flusso. Descriviamo l’uso della collagenasi IV, DNasi 1 e separazione meccanica per la digestione del tessuto del fegato in una sospensione unicellulare. Inoltre descriviamo l’uso di gradienti di densità di iodixanol per l’isolamento di cellule non parenchimali (NPC) e per eliminare i detriti cellulari. Infine, utilizzando più marcatori, determinare la strategia di gating di citometria a flusso ottimale per identificare LECs dal fegato con PDPN come il marcatore predominante.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’importanza complessiva di LECs in omeostasi immunitaria e regolamento è venuta recentemente alla luce25. Gran parte della letteratura pubblicata linfatica si concentra sulla pelle e nei linfonodi; Tuttavia, vasi linfatici si trovano in tutto il corpo26 e, così, è necessaria la nostra comprensione della loro importanza in diversi organi. Qui vi mostriamo un metodo in cui LECs nel fegato può essere studiata su una base di cella per capire meglio la loro espressione simu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare il GI e programmi Immune innata di fegato per sostegno monetario di questo progetto. B.A.J.T. è anche finanziato dalla AI121209 R01.
Materials
| Clicks/EHAA media | Irvine Scientific | 9195 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical corporation | LS004188 | |
| DNase I | Worthington Biochemical corporation | LS002145 | Deoxyribonuclease 1 |
| OptiPrep | Sigma Aldrich | D1556 | Density Gradient Medium |
| V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1 | BD biosciences | 562232 | |
| FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1 | Biolegend | 134706 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102422 | |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31( clone 390) | Biolegend | 102420 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1) | Biolegend | 127410 | Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN) |
| APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11 | Biolegend | 103138 | |
| FITC anti mouse CD16/32 (clone 93) | Biolegend | 101306 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32( clone 93) | Biolegend | 101324 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| ghost red 780 viability dye | TONBO biosceinces | 3-0865-T100 | |
| APC syrian hamster IgG (clone SHG-1) | Biolegened | 402102 | |
| PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) | Biolegend | 400531 | |
| FITC rat IgG2 (clone eBR2a) | ebioscience | 1-4321-80 | |
| Anti mouse LYVE1 (clone 223322) | R&D systems | FAB2125A | |
| anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078) | abcam | ab181598 | |
| anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1) | Bio-rad | MCA497 | |
| BSA (fraction V) | Fischer | BP1600-100 | Bovine Serum Albumin (BSA) |
| Goat serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| EDTA | VWR | E177 | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer |
| Ammonium Chloride | Fischer | A687-500 | for RBC Lysis buffer |
| Potassium Bicarbonate | Fischer | P184-500 | for RBC Lysis buffer |
| Scalpel | Feather | 2975#21 | |
| 100um cell strainer | Fischer | 22363549 | |
| 2.4G2 | in house/ATCC | ATCC HB-197 | FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11550 | |
| 96 well plate | Corning | 3788 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| 50 ml conical | Truline | TR2004 | |
| 15 ml conical | Falcon | 352196 | |
| 1 ml Pipete tip | USA scientific | 1111-2721 | |
| 200 µl pipete tip | USA scientific | 1110-1700 | |
| 10 µl pipete tip | USA scientific | 1111-3700 | |
| seriological 10ml pipete | greiner bio-one | 607107 | |
| seriological 5ml pipete | greiner bio-one | 606107 | |
| Cell incubator | Fischer | Heracell 160i | |
| BD FacsCanto II flow cytometer | BD biosciences | ||
| Clinical Centrifuge | Beckman coulter | model X-14R |
References
- Tanaka, M., Iwakiri, Y. Lymphatics in the liver. Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).
- Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis. The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).
- Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
- Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
- Cohen, J. N., et al. Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment. PLoS One. 9 (2), e87740 (2014).
- Rouhani, S. J., et al. Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction. Nature Communications. 6, 6771 (2015).
- Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
- Dubrot, J., et al. Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance. Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).
- Hirosue, S., et al. Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells. Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).
- Lund, A. W., et al. VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics. Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).
- Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
- Swartz, M. A. Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression. Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).
- Dietrich, T., et al. Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation. Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).
- Kedl, R., et al. Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction. Nature Communications. 8, 2034 (2017).
- Kedl, R. M., Tamburini, B. A. Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium. European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).
- Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection. Nature Communications. 5, 3989 (2014).
- Yokomori, H., et al. Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver–re-evaluations of microlymphatic abnormalities. BMC Gastroenterology. 10, 131 (2010).
- Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors. Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).
- Dudas, J., et al. Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from “oval cells”. Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).
- Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
- Amatschek, S., et al. Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment. Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).
- Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo. Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).
- Shay, T., Kang, J. Immunological Genome Project and systems immunology. Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).
- Li, B., et al. Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes. Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).
- Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity. Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).
- Olszewski, W. L. The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions. Lymphatic Research and Biology. 1 (1), 11-21 (2003).
