Rötning av murina levern för ett flöde flödescytometrisk analys av lymfatiska endotelceller
Summary
Målet med detta protokoll är att identifiera lymfatiska endotelceller populationer inom levern med beskrivs märkpennor. Vi använder kollagenas IV och DNAS och en skonsam malning av vävnad, kombinerat med flödescytometri, för att identifiera en distinkt befolkning av lymfatiska endotelceller.
Abstract
Inom levern, lymfkärl finns inom portalen triaden, och deras beskrivs funktion är att ta bort interstitiell vätska från levern till lymfkörtlarna där cellulära skräp och antigener kan vara tillfrågade. Vi är mycket intresserade av att förstå hur den lymfatiska kärl kan vara inblandade i inflammation och immunceller funktion inom levern. Mycket lite har dock publicerats om inrättande av matsmältningen protokoll för isolering av lymfatiska endotelceller (LECs) från levern eller specifika markörer som kan användas för att utvärdera levern LECs på basis per cell. Därför optimerat vi en metod för matsmältningen och färgning av levern för att utvärdera LEC befolkningen i levern. Vi är övertygade om att den metod som anges här kommer att vara användbart för identifiering och isolering av LECs från levern och stärker vår förståelse av hur LECs bemöta den levern mikromiljö.
Introduction
Lymfkärl och LECs roll i levern är inte väl förstått. Medan lymfkärl finns inom portalen triaden av levern1 och expandera under sjukdom2, förstås mycket lite när det gäller funktion och fenotyp av LECs inom levern. Med upptäckten av markörer som finns främst på LECs3, fyller vikten av dessa celler inom olika vävnad nischer i homeostas och sjukdom en viktig lucka i vår förståelse. LECs har en viktig roll i att upprätthålla perifer tolerans i lymfkörteln och metastaserande tumörer genom att interagera direkt med T celler4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. LECs i lymfkörteln kan främja skyddande immunitet via deras interaktioner med flyttande dendritiska celler14,15,16. Därför finns det flera roller för LECs som kan vara specifika för vävnader och interaktioner där de förekommer. Dock är mycket lite förstås om hur LECs interagerar med immunceller i vävnaden eller hur LECs fungerar i olika organsystem; Således, utvärdera LECs på basis per cell inom levern eller andra organ kan leda till framsteg i hur LECs program vävnadsspecifika immunitet. Medan mycket av den litteratur som fokuserar på LECs i levern använder mikroskopi för att visualisera LECS-servern med hjälp av en eller två markörer och morfologi17, har mycket lite gjorts för att särskilt utvärdera LECs på en cell för cell grund med hjälp av flödescytometri, men en studie utvärdera skillnaderna mellan leverns sinusformig endothelial celler (LSECs) och LECs18. Att kunna analysera LEC populationer i levern av flödescytometri kan den djupgående studien av LEC fenotyp under normala homeostas eller sjukdom.
För att utvärdera LECs av flödescytometri, behövs flera yta markörer. Typiskt, LECs visualiseras genom uttryck av prospero-relaterade homeobox 1 (Prox-1), lymfatiska kärl endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1) eller en vaskulär endotelial tillväxtfaktor receptor 3 (VEGFR3) med mikroskopi. Dock i levern är uttrycket av dessa markörer inte begränsad till LECs. Prox-1 uttrycks allmänt av hepatocyter under levern utveckling, förnyelse och skada19och LYVE1 och VEGFR3 uttrycks av leverns sinusformig endothelial celler18. I lymfkörteln, LECs identifieras med flödescytometri som kluster av differentiering (CD) CD45-, CD31 + och podoplanin + (PDPN)16. Detta tillvägagångssätt är dock alltför minimal att isolera LECs i levern eftersom CD45 – CD31 + celler kommer att fånga endotelceller, och den dominerande befolkningen av vascular endothelial celler i levern är LSECs. Således behövs andra markörer för att skilja sällsynta LEC befolkningen från den rikliga LSEC befolkningen. Både CD16/32 (uttryckt i mogna LSECs18) och CD146 (en gemensam vaskulära endotelceller markör som huvudsakligen som uttrycks inom den leverskada sinusoider av leverns sinusformig endothelial celler20 med liten eller ingen uttryck av lymfatiska endotelceller21) var kandidat markörer.
Därför optimerat vi en metod för att isolera och visualisera LECs i levern med hjälp av den ovan markörer, CD45, CD31, CD146, CD16/32 och PDPN för flödescytometri. Vi beskriver användning av kollagenas IV, DNase 1 och mekanisk separation för levervävnad matsmältningen till en enskild cell suspension. Vi beskriver också användningen av iodixanol täthetlutning för isolering av icke-parenkymal celler (NPC) och att eliminera cellulära skräp. Slutligen fastställa använder flera markörer, vi optimalt flöde flödescytometri Usenets strategin att identifiera LECs från levern med PDPN som den dominerande markören.
Protocol
Representative Results
Discussion
Totala vikten av LECs i immun homeostas och förordning har nyligen kommit till ljus25. Mycket av den publicerade lymfatiska litteraturen fokuserar på hud och lymfkörtlar; dock lymfkärlen finns i hela kroppen26 och, således, vår förståelse av deras betydelse i olika organ behövs. Här visar vi en metod där LECs i levern kan studeras på en cell för cell grund för att bättre förstå deras samtidiga uttryck för olika yta markörer, cytokiner, chemokiner och intr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka de GI och levern medfödd immun program för monetära stöd för detta projekt. B.A.J.T. finansieras också av R01 AI121209.
Materials
| Clicks/EHAA media | Irvine Scientific | 9195 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical corporation | LS004188 | |
| DNase I | Worthington Biochemical corporation | LS002145 | Deoxyribonuclease 1 |
| OptiPrep | Sigma Aldrich | D1556 | Density Gradient Medium |
| V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1 | BD biosciences | 562232 | |
| FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1 | Biolegend | 134706 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102422 | |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31( clone 390) | Biolegend | 102420 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1) | Biolegend | 127410 | Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN) |
| APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11 | Biolegend | 103138 | |
| FITC anti mouse CD16/32 (clone 93) | Biolegend | 101306 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32( clone 93) | Biolegend | 101324 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| ghost red 780 viability dye | TONBO biosceinces | 3-0865-T100 | |
| APC syrian hamster IgG (clone SHG-1) | Biolegened | 402102 | |
| PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) | Biolegend | 400531 | |
| FITC rat IgG2 (clone eBR2a) | ebioscience | 1-4321-80 | |
| Anti mouse LYVE1 (clone 223322) | R&D systems | FAB2125A | |
| anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078) | abcam | ab181598 | |
| anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1) | Bio-rad | MCA497 | |
| BSA (fraction V) | Fischer | BP1600-100 | Bovine Serum Albumin (BSA) |
| Goat serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| EDTA | VWR | E177 | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer |
| Ammonium Chloride | Fischer | A687-500 | for RBC Lysis buffer |
| Potassium Bicarbonate | Fischer | P184-500 | for RBC Lysis buffer |
| Scalpel | Feather | 2975#21 | |
| 100um cell strainer | Fischer | 22363549 | |
| 2.4G2 | in house/ATCC | ATCC HB-197 | FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11550 | |
| 96 well plate | Corning | 3788 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| 50 ml conical | Truline | TR2004 | |
| 15 ml conical | Falcon | 352196 | |
| 1 ml Pipete tip | USA scientific | 1111-2721 | |
| 200 µl pipete tip | USA scientific | 1110-1700 | |
| 10 µl pipete tip | USA scientific | 1111-3700 | |
| seriological 10ml pipete | greiner bio-one | 607107 | |
| seriological 5ml pipete | greiner bio-one | 606107 | |
| Cell incubator | Fischer | Heracell 160i | |
| BD FacsCanto II flow cytometer | BD biosciences | ||
| Clinical Centrifuge | Beckman coulter | model X-14R |
References
- Tanaka, M., Iwakiri, Y. Lymphatics in the liver. Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).
- Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis. The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).
- Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
- Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
- Cohen, J. N., et al. Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment. PLoS One. 9 (2), e87740 (2014).
- Rouhani, S. J., et al. Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction. Nature Communications. 6, 6771 (2015).
- Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
- Dubrot, J., et al. Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance. Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).
- Hirosue, S., et al. Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells. Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).
- Lund, A. W., et al. VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics. Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).
- Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
- Swartz, M. A. Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression. Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).
- Dietrich, T., et al. Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation. Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).
- Kedl, R., et al. Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction. Nature Communications. 8, 2034 (2017).
- Kedl, R. M., Tamburini, B. A. Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium. European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).
- Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection. Nature Communications. 5, 3989 (2014).
- Yokomori, H., et al. Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver–re-evaluations of microlymphatic abnormalities. BMC Gastroenterology. 10, 131 (2010).
- Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors. Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).
- Dudas, J., et al. Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from “oval cells”. Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).
- Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
- Amatschek, S., et al. Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment. Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).
- Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo. Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).
- Shay, T., Kang, J. Immunological Genome Project and systems immunology. Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).
- Li, B., et al. Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes. Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).
- Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity. Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).
- Olszewski, W. L. The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions. Lymphatic Research and Biology. 1 (1), 11-21 (2003).
