Fluorimetri teknikker til vurdering af Sperm membraner
Summary
Vi præsenterer her, metoder til at vurdere spermatozoan membran integritet, en cellulær funktion tilknyttet sperm befrugtning kompetence. Vi beskriver tre teknikker for fluorimetri vurdering af sperm membraner: samtidige farvning med specifikke fluorescerende sonder, Fluorescens mikroskopi og avancerede sæd-dedikeret flowcytometri. Eksempler på kombinerer metoder er også præsenteret.
Abstract
Standard spermiograms der beskriver sædkvalitet er for det meste baseret på de fysiologiske og visuelle parametre, såsom ejakulatvolumen og koncentration, motilitet og progressive motilitet, og sperm morfologi og levedygtighed. Men ingen af disse vurderinger er gode nok til at forudsige sædkvaliteten. I betragtning af at vedligeholdelse af sperm levedygtighed og befrugtning potentielle afhænger membran integritet og intracellulære funktionalitet, kan evaluering af disse parametre aktiverer en bedre forudsigelse af sperm befrugtning kompetence. Her beskriver vi tre mulige metoder til at evaluere sædkvalitet ved hjælp af specifikke fluorescerende sonder kombineret med Fluorescens mikroskopi eller flow flowcytometri analyser. Analyser vurderes plasma membran integritet ved hjælp af 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og propidium Iodid (PI), acrosomal membran integritet ved hjælp af fluorescein isothiocyanat-konjugeret Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) og mitokondrielle membran integritet ved hjælp af 5, 5′, 6, 6′-tetra-chlor-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine Iodid (JC-1). Kombinationer af disse metoder er også præsenteret. For eksempel, brug af annexin V kombineret med PI fluorokromer muliggør vurdering af apoptose og beregningen af andelen af apoptotiske sæd (apoptotiske indeks). Vi mener, at disse metoder, som er baseret på undersøge sædcelle membraner, er meget nyttige til vurdering af sædkvalitet.
Introduction
Integritet og funktionalitet af sperm membraner er nogle af de faktorer, der angiver sperm levedygtighed og befrugtning potentielle. Plasmamembran fungerer som en sikkerhedsbarriere mellem intracellulære og ekstracellulære rum, dermed bevare cellulære osmotiske balance1. Nogen stress, der inducerer skader på plasma membran integritet kan forringe homøostase, reducere levedygtighed og befrugtning kapacitet og øge celledød. For eksempel reducerer kryopræservering sperm levedygtighed skyldes til skade på sin plasma membran, som følge af ændringer i temperatur og osmotisk stress2. Vi har tidligere rapporteret at udsætte bull sæd til lave koncentrationer af fødevarebårne kontaminanter som pesticid atrazin, dets vigtigste metabolit diaminochlorotriazine eller mykotoksiner aflatoksin B1, reducerer sperm levedygtighed1,3 . Dette blev bestemt ved mærkning dobbelt-strenget DNA med DAPI i kombination med PI, som binder sig til DNA af celler med en beskadiget plasmamembran.
Acrosome reaktion (AR) indebærer fusion af den ydre acrosome membran og den overliggende plasma membran resulterer i frigivelse af acrosomal enzymer4,5. Disse er væsentlige begivenheder for zona pellucida penetration og yderligere sammenlægning af sperm med oocyt6. Evaluering af acrosomal membran integritet udgør derfor, en nyttig parameter for at evaluere sædkvalitet og mandlige fertilitet7,8,9. Flere fluorescerende teknikker er velegnet til kontrol af acrosome integritet, FITC-PNA eller FITC-PSA8,10. I vores tidligere undersøgelser, ved hjælp af mønstre af FITC-PSA farvning1,3, vi fastsat præcise definitioner for (i) intakt acrosome, (ii) beskadiget acrosome membran og (iii) reagerede acrosome. I den foreliggende betænkning, vi vurdere acrosome status ved hjælp af sæd-dedikeret flowcytometri og sammenligne resultaterne til dem, der bruger Fluorescens mikroskopi.
Mitokondrier er multifunktionelle organeller involveret, blandt andre ting, ATP syntesen, reaktive ilt arter produktion, calcium signalering apoptose. Fysiologiske dysfunktioner, herunder mandlige og kvindelige infertilitet, er forbundet med ændrede mitokondrie funktion11. Sperm mitokondrier er arrangeret i midpiece og spiller en afgørende rolle i sperm motilitet12. Det er blevet godt modtaget, høj mitokondrielle membran potentiale (ΔΨm) er forbundet med normale motilitet og høj befrugtning kapacitet13. Derimod lave ΔΨm er forbundet med en forhøjet niveau af reaktive ilt arter og reduceret befrugtning sats14. Ikke desto mindre kan forskellige miljømæssige forbindelser, for eksempel endokrine disruptorer, fremkalde cellulært stress og føre til en forbigående stigning i ΔΨm, hyperpolarisering1,3, øget produktion af frie radikaler og i sidste ende, apoptose15. Fluorescerende sonden 5, 5′, 6, 6′-tetra-chlor-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine Iodid (JC-1) giver mulighed for undersøgelse for eksempel virkninger af fødevarebårne toksiner på sæd ΔΨm1,3.
Standard spermiograms, baseret på fysiologiske og morfologiske parametre, der ikke er gode nok til at forudsige sædkvaliteten. Mere præcise metoder er nødvendige for at sikre sædkvalitet. Her, vi give to mulige metoder til at bestemme sædkvalitet baseret på vurderinger af sperm membraner: samtidige firedobbelt farvning med specifikke fluorescerende sonder og Fluorescens mikroskopi, beskrevet i vores undersøgelser1,3 og avancerede sæd-dedikeret flowcytometri, for nylig udnyttet i vores laboratorium, og allerede bruges af andre16,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sperm befrugtning potentielle afhænger af flere faktorer som afspejler dens kvalitet. En høj koncentration af sædceller og en høj andel af meget gradvis motile sædceller kan anses for høj kvalitet sæd. Dog sådan evaluering tager ikke hensyn til andre cellulære og funktionelle parametre. Brug af ‘bænk-top’ microcapillary flow forskellige kan tilpasses nemt til evaluering af forskellige sperm strukturer ved hjælp af fluorescerende sonder, som tidligere vist af andre17 og demonstreret heri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke “SION” israelsk selskab for kunstig befrugtning og opdræt (Hafetz-Haim, Israel) for deres hjælp og samarbejde og Ms. Li Na (IMV teknologier, L’Aigle, Frankrig) for at få hjælp med opsætning af instrument og uddannelse.
Materials
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] | Sigma | M1254 | |
| PBS | Sigma | P5493 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Ethanol absolute | Sigma | 64-17-5 | |
| Hemacytometer | Neubauer Germany | hemocytometer | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542 | fluorescent probe |
| PI (propidium iodide ) | Sigma | P4170 | fluorescent probe |
| FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) | Sigma | L0770 | fluorescent probe |
| JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) | ENZOBiochem, New York, NY, USA | ENZ52304 | fluorescent probe |
| Annexin V conjugated to FITC | MACS, Miltenyi Biotec | 130-093-060 | fluorescent probe |
| Annexin V binding buffer 20X stock solution | MACS, Miltenyi Biotec | 130-092-820 | buffer |
| Nikon Eclipse, TE-2000-u | Nikon, Tokyo, Japan | inverted fluorescence microscope | |
| Nis Elements | Nikon, Tokyo, Japan | software | |
| Nikon DXM1200F | Nikon, Tokyo, Japan | digital camera | |
| Guava EasyCyte Plus | IMV Technologies, L'Aigle, France | microcapillary sperm flow cytometer | |
| CytoSoft | Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies | software | |
| Buffered solution for cytometry | IMV Technologies, L'Aigle, France | 023862 | buffer |
| Viability and concentration kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024708 | kit for viability assessment |
| Mitochondrial activity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024864 | kit for mitochondrial activity assessment |
| Viability & acrosome integrity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 025293 | kit for acrosome integrity assessment |
| JMP-13 | SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA | software | |
| Bovine sperm | "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel |
References
- Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality. Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).
- Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence. Toxicology. 393, 42-50 (2018).
- Beltrán, C., et al. Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).
- Breitbart, H. Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).
- Almadaly, E., et al. Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status. Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).
- Jankovicová, J., Simon, M., Antalíková, J., Horovská, L. Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods. Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).
- Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).
- Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin. Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).
- Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes. Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).
- Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells. Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).
- Eddy, E. M., O’Brien, A. . The spermatozoon. , (1994).
- Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability. Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).
- Espinoza, J. a., Paasch, U., Villegas, J. V. Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm. Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).
- Hüttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).
- Sellem, E., et al. Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen. Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).
- Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis. Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).
- Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry. Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).
