Флуориметрическое методы для оценки мембран сперматозоидов
Summary
Здесь мы представляем методологий для оценки целостности мембраны spermatozoan, сотовой функция, связанный с спермы оплодотворение компетенции. Мы опишем три методики для оценки Флуориметрическое мембран сперматозоидов: одновременное окрашивание с конкретными флуоресцентных зондов, флуоресцентной микроскопии и передовые спермы посвященный проточной цитометрии. Также представлены примеры объединения методологии.
Abstract
Стандартный спермиограммы, описывающих качество спермы главным образом основаны на физиологические и визуальных параметров, таких как объем эякулята и концентрации, подвижности и прямолинейное и морфология спермы и жизнеспособность. Однако ни один из этих оценок является достаточно хорошим предсказать качество спермы. Учитывая, что поддержание жизнеспособности сперматозоидов и оплодотворение потенциал зависит от целостности мембраны и внутриклеточных функциональность, оценки этих параметров может позволить лучше прогноза спермы оплодотворение компетенции. Здесь мы опишем три возможные методы для оценки качества спермы с помощью конкретных флуоресцентных зондов, в сочетании с флуоресцентной микроскопии или потока цитометрии анализы. Анализ начисленных плазматической мембраны целостности с помощью 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) и пропидий йодидом (PI), методу мембраны целостности с помощью флуоресцеин конъюгированных Изотиоцианаты Pisum sativum агглютининов (FITC-PSA) и Митохондриальные мембраны целостность с помощью 5, 5′, 6, 6′-тетра хлоро-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl карбоцианиновыми йодид (JC-1). Также представлены комбинации этих методов. Например использование annexin V в сочетании с PI флуорохромов позволяет оценки апоптоза и расчета доли apoptotic спермы (apoptotic индекс). Мы считаем, что эти методологии, основанные на изучении мембран сперматозоидов, очень полезны для оценки качества спермы.
Introduction
Целостности и функциональности мембран сперматозоидов являются некоторые из факторов, свидетельствующих о спермы жизнеспособность и потенциал оплодотворение. Плазматической мембраны действует как барьер между внутриклеточные и внеклеточной отсеков, тем самым сохраняя сотовой осмотического равновесия1. Любой стресс, который вызывает повреждение целостности плазматической мембраны может ухудшить гомеостаза, уменьшить жизнеспособность и оплодотворение потенциала и повышения клеточной смерти. Например криоконсервация уменьшает жизнеспособность спермы из-за повреждения его плазматической мембраны, в результате изменений температуры и осмотического стресса2. Ранее мы сообщали, что разоблачение Сперма быков в низких концентрациях пищевых загрязнителей, таких как пестицида Атразин, его основной метаболит diaminochlorotriazine или микотоксинов афлатоксин B1, уменьшает спермы жизнеспособность1,3 . Это было обусловлено маркировки double-stranded дна с DAPI в сочетании с PI, который связывается с ДНК клеток с поврежденной плазматической мембраны.
Акросома реакции (AR) включает в себя слияние внешних Акросома мембраны и вышележащих плазматической мембраны, приводит в выпуске методу ферменты4,5. Это основные события-вителлинового проникновения и дальнейшее слияние спермы с ооцитов6. Таким образом оценки целостности методу мембраны является полезным параметром для оценки качества спермы и мужской фертильности7,8,9. Некоторые люминесцентные методы подходят для проверки целостности Акросома, FITC-PNA или FITC-PSA8,10. В наших предыдущих исследований, используя шаблоны FITC-PSA пятная1,3мы представили точные определения для (i) нетронутыми Акросома, (ii) поврежден Акросома мембраны и (iii) отреагировали Акросома. В настоящем докладе мы оцениваем статус Акросома сперматозоидов посвященный проточной цитометрии и сравнить результаты для тех, кто с помощью микроскопии флуоресцирования.
Митохондрии являются многофункциональный органеллы связанных, среди прочего, СПС синтеза, реактивнооксигенных видов производства, кальция сигнализации и апоптоз. Физиологических расстройств, включая мужского и женского бесплодия, связаны с измененной митохондриальной функции11. Митохондрии спермы расположены в midpiece и играть решающую роль в подвижности спермы12. Также принято что высокий митохондриальной мембранного потенциала (ΔΨm) связан с нормальной моторики и высокой оплодотворение потенциала13. Напротив низкая ΔΨm ассоциируется с повышенным уровнем реактивнооксигенных видов и снижение оплодотворение ставка14. Тем не менее различные экологические соединений, например эндокринные расстройства, могут побудить клеточного стресса и привести к преходящее повышение в ΔΨm, гиперполяризации1,3, рост производства, из свободных радикалов и в конечном итоге, апоптоз15. Флуоресцентный зонд 5, 5′, 6, 6′-тетра хлоро-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl карбоцианиновыми йодид (JC-1) позволяет, например, изучение последствий пищевого токсинов на сперму ΔΨm1,3.
Стандартный спермиограммы, основанные на физиологических и морфологических параметров, не являются достаточно хорошими для того предсказать качество спермы. Для обеспечения качества спермы требуются более точные методы. Здесь, мы предлагаем две возможные методы для определения качества спермы, основанные на оценках мембран сперматозоидов: одновременное четырехместные окрашивание с конкретными флуоресцентных зондов и микроскопии флуоресцирования, описанные в наших исследованиях1,3 и передовые спермы посвященный проточной цитометрии, недавно использовались в нашей лаборатории и уже используется другими16,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Спермы оплодотворение потенциал зависит от нескольких факторов, отражающих его качество. Высокая концентрация сперматозоидов и высокая доля весьма подвижных сперматозоидов может считаться высокого качества спермы. Тем не менее, такая оценка не принимать во внимание другие сотовые и …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить израильская компания «СЬОН» для искусственного осеменения и селекции (Хефец Хаим, Израиль) за их помощь и сотрудничество и г-жа Li Na (IMV технологий, L’Aigle, Франция) для помощи с инструмент установки и обучения.
Materials
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] | Sigma | M1254 | |
| PBS | Sigma | P5493 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Ethanol absolute | Sigma | 64-17-5 | |
| Hemacytometer | Neubauer Germany | hemocytometer | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542 | fluorescent probe |
| PI (propidium iodide ) | Sigma | P4170 | fluorescent probe |
| FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) | Sigma | L0770 | fluorescent probe |
| JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) | ENZOBiochem, New York, NY, USA | ENZ52304 | fluorescent probe |
| Annexin V conjugated to FITC | MACS, Miltenyi Biotec | 130-093-060 | fluorescent probe |
| Annexin V binding buffer 20X stock solution | MACS, Miltenyi Biotec | 130-092-820 | buffer |
| Nikon Eclipse, TE-2000-u | Nikon, Tokyo, Japan | inverted fluorescence microscope | |
| Nis Elements | Nikon, Tokyo, Japan | software | |
| Nikon DXM1200F | Nikon, Tokyo, Japan | digital camera | |
| Guava EasyCyte Plus | IMV Technologies, L'Aigle, France | microcapillary sperm flow cytometer | |
| CytoSoft | Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies | software | |
| Buffered solution for cytometry | IMV Technologies, L'Aigle, France | 023862 | buffer |
| Viability and concentration kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024708 | kit for viability assessment |
| Mitochondrial activity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024864 | kit for mitochondrial activity assessment |
| Viability & acrosome integrity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 025293 | kit for acrosome integrity assessment |
| JMP-13 | SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA | software | |
| Bovine sperm | "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel |
References
- Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality. Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).
- Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence. Toxicology. 393, 42-50 (2018).
- Beltrán, C., et al. Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).
- Breitbart, H. Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).
- Almadaly, E., et al. Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status. Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).
- Jankovicová, J., Simon, M., Antalíková, J., Horovská, L. Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods. Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).
- Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).
- Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin. Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).
- Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes. Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).
- Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells. Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).
- Eddy, E. M., O’Brien, A. . The spermatozoon. , (1994).
- Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability. Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).
- Espinoza, J. a., Paasch, U., Villegas, J. V. Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm. Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).
- Hüttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).
- Sellem, E., et al. Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen. Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).
- Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis. Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).
- Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry. Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).
