精子膜评价的荧光技术
Summary
在这里, 我们提出的方法来评估精子细胞膜的完整性, 一个细胞特征与精子受精能力。我们描述了精子膜荧光测量评估的三种技术: 与特定荧光探针同时染色, 荧光显微镜, 和先进的精子专用流式细胞仪。还介绍了合并这些方法的实例。
Abstract
描述精子质量的标准精子图主要基于生理和视觉参数, 如射精体积和浓度、运动和渐进运动、精子形态和活力。然而, 这些评估都不足以预测精液质量。鉴于维持精子的活力和受精潜力取决于细胞膜的完整性和细胞内的功能, 对这些参数的评估可能有助于更好地预测精子受精能力。在这里, 我们描述了三种可行的方法来评估精子质量使用特定的荧光探针结合荧光显微镜或流式细胞仪分析。使用 4 ‘, 6-二胺-2-苯丙二醇 (dapi) 和碘化物 (pi) 和顺丁烯 (pi) 评估了评估的质膜完整性, 使用荧光素异硫氰酸酯结合化皮素凝集素 (fitc-sa) 和线粒体膜完整性使用 5, 5 ‘, 6, 6 ‘-四氯-1, 1 ‘, 3, 3 ‘-四乙基苯并咪唑基卡宾氰酸酯 (jc-1)。还介绍了这些方法的组合。例如, 使用环素 v 与 pi 荧光结合, 可以评估细胞凋亡和计算凋亡精子的比例 (凋亡指数)。我们认为, 这些方法, 这是基于检查精子膜, 是非常有用的精子质量的评估。
Introduction
精子膜的完整性和功能是表明精子活力和受精潜力的几个因素。质膜作为细胞内和细胞外隔间之间的屏障, 从而保持细胞渗透平衡1。任何导致对质膜完整性的损害的压力都可能损害体内平衡, 降低生存能力和受精能力, 并增加细胞死亡。例如, 冷冻保存降低精子的生存能力, 由于其质膜的损害, 由于温度变化和渗透应力2。我们以前报告说, 将公牛精子暴露在低浓度的食源性污染物中, 如农药阿特拉津、其主要代谢物二胺氯水嗪或霉菌毒素黄曲霉毒素 b1, 降低精子的生存能力1,3.这是通过用 dapi 与 pi 组合标记双链 dna 来确定的, pi 与受损质膜的细胞 dna 结合在一起。
伴随反应 (ar) 包括外顶膜和覆盖质膜的融合, 导致顶体酶4,5的释放。这些都是重要的事件, 为氧化锆渗透和进一步合并的精子与卵母细胞6。因此, 对顶体膜完整性的评价是评价精液质量和男性生育力的一个有用参数, 7,8,9。几种荧光技术适用于对丙烯酸的完整性验证, fitc-pna 或 fitc-psc8,10。在我们以前的研究中, 利用 fitc-sa 染色1,3 的模式, 我们提供了准确的定义, (i) 完整的顶体, (ii) 受损的尖锐湿疣膜和 (iii) 反应的顶体。在本报告中, 我们使用精子专用流式细胞仪评估顶体状态, 并将结果与荧光显微镜的结果进行比较。
线粒体是参与 atp 合成、活性氧生产、钙信号转导和凋亡等方面的多功能细胞器。生理功能障碍, 包括男性和女性不育, 与线粒体功能改变11。精子线粒体排列在中段, 在精子活力12中发挥着至关重要的作用。人们普遍认为, 高线粒体膜电位 (m) 与正常运动和高施肥能力有关。相反, 低 m 与活性氧物种水平升高和受精率降低14有关.尽管如此, 各种环境化合物, 例如内分泌干扰物, 可以诱导细胞压力, 并导致短暂增加的 m, 超极化1,3, 自由基的生产增加, 并最终,细胞凋亡15。荧光探针 5, 5 ‘, 6, 6 ‘-四氯-1, 1 ‘, 3, 3 ‘-四乙基苯并咪唑基碘化物 (jc-1), 使检查例如, 食源性毒素对精子的影响 m1,3。
标准的精原图, 基于生理和形态学参数, 是不够好预测精液质量。需要更准确的方法来确保精子质量。在这里, 我们提供了两种可行的方法来确定精子质量的基础上, 精子膜的评估: 同时四染色与特定的荧光探针和荧光显微镜, 在我们的研究1,3中描述和先进的精子专用流式细胞仪, 最近在我们的实验室使用, 并已被其他人使用 16,17,18。
Protocol
Representative Results
Discussion
精子受精的可能性取决于反映其质量的多种因素。高浓度的精子和高比例的高度运动精子可能被认为是高质量的精液。然而, 这种评价没有考虑到其他细胞和功能参数。使用 “台式” 微毛细管流细胞仪可以很容易地适应评估各种精子结构使用荧光探针, 如前面的其他17和演示 (技术 #3)。例如, 精子顶体完整性对于成功的自然受精的发生是非常重要的, 因此, 准确的评估顶体状态是必要…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢 “sion” 以色列公司的人工授精和育种 (以色列 Hafetz-Haim) 的帮助与合作, 并感谢 li na 女士 (imv technologies, l ‘ aigle, 法国) 在仪器设置和培训方面提供的协助。
Materials
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] | Sigma | M1254 | |
| PBS | Sigma | P5493 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Ethanol absolute | Sigma | 64-17-5 | |
| Hemacytometer | Neubauer Germany | hemocytometer | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542 | fluorescent probe |
| PI (propidium iodide ) | Sigma | P4170 | fluorescent probe |
| FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) | Sigma | L0770 | fluorescent probe |
| JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) | ENZOBiochem, New York, NY, USA | ENZ52304 | fluorescent probe |
| Annexin V conjugated to FITC | MACS, Miltenyi Biotec | 130-093-060 | fluorescent probe |
| Annexin V binding buffer 20X stock solution | MACS, Miltenyi Biotec | 130-092-820 | buffer |
| Nikon Eclipse, TE-2000-u | Nikon, Tokyo, Japan | inverted fluorescence microscope | |
| Nis Elements | Nikon, Tokyo, Japan | software | |
| Nikon DXM1200F | Nikon, Tokyo, Japan | digital camera | |
| Guava EasyCyte Plus | IMV Technologies, L'Aigle, France | microcapillary sperm flow cytometer | |
| CytoSoft | Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies | software | |
| Buffered solution for cytometry | IMV Technologies, L'Aigle, France | 023862 | buffer |
| Viability and concentration kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024708 | kit for viability assessment |
| Mitochondrial activity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024864 | kit for mitochondrial activity assessment |
| Viability & acrosome integrity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 025293 | kit for acrosome integrity assessment |
| JMP-13 | SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA | software | |
| Bovine sperm | "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel |
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