शुक्राणु झिल्ली के आकलन के लिए Fluorimetric तकनीक
Summary
यहां, हम वर्तमान के तरीके spermatozoan झिल्ली अखंडता, एक सेलुलर शुक्राणु निषेचन क्षमता के साथ जुड़े सुविधा का मूल्यांकन करने के लिए । हम शुक्राणु झिल्ली के fluorimetric आकलन के लिए तीन तकनीकों का वर्णन: एक साथ विशिष्ट फ्लोरोसेंट जांच के साथ धुंधला, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, और उन्नत शुक्राणु-समर्पित प्रवाह cytometry. के तरीके के संयोजन के उदाहरण भी प्रस्तुत कर रहे हैं ।
Abstract
मानक spermiograms का वर्णन शुक्राणु की गुणवत्ता ज्यादातर शारीरिक और दृश्य मानकों पर आधारित हैं, जैसे बोल पड़ना मात्रा और एकाग्रता, गतिशीलता और प्रगतिशील गतिशीलता, और शुक्राणु आकृति विज्ञान और व्यवहार्यता । हालांकि, इन आकलनों में से कोई भी वीर्य की गुणवत्ता की भविष्यवाणी करने के लिए काफी अच्छा है । यह देखते हुए कि शुक्राणु व्यवहार्यता और निषेचन क्षमता के रखरखाव झिल्ली अखंडता और intracellular कार्यशीलता पर निर्भर करता है, इन मापदंडों का मूल्यांकन शुक्राणु निषेचन क्षमता का एक बेहतर भविष्यवाणी सक्षम हो सकता है । यहां, हम विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी या प्रवाह cytometry विश्लेषण के साथ संयुक्त जांच का उपयोग शुक्राणु गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए तीन व्यवहार्य तरीकों का वर्णन । विश्लेषण प्लाज्मा झिल्ली अखंडता का उपयोग 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) और propidium आयोडाइड (PI), acrosomal झिल्ली अखंडता का उपयोग fluorescein isothiocyanate-संयुग्मित Pisum सटिवुम agglutinin (FITC-पीएसए) और mitochondrial झिल्ली अखंडता का उपयोग 5, 5 ‘, 6, 6 ‘-टेट्रा-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-1, 1 ‘, 3, 3 ‘-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine आयोडाइड (जे. ए.-1). इन पद्धतियों के युग्म भी प्रस्तुत हैं. उदाहरण के लिए, annexin वी PI fluorochromes के साथ संयुक्त का उपयोग apoptosis का आकलन करने में सक्षम बनाता है और अपोप्तोटिक शुक्राणु (अपोप्तोटिक सूचकांक) के अनुपात की गणना. हम मानते है कि इन तरीकों, जो spermatozoon झिल्ली की जांच पर आधारित है शुक्राणु की गुणवत्ता के मूल्यांकन के लिए बहुत उपयोगी होते हैं ।
Introduction
अखंडता और शुक्राणु झिल्ली की कार्यक्षमता शुक्राणु व्यवहार्यता और निषेचन की क्षमता का संकेत कारकों में से कुछ हैं । प्लाज्मा झिल्ली intracellular और extracellular डिब्बों के बीच एक बाधा के रूप में कार्य करता है, जिससे सेलुलर आसमाटिक संतुलन को बनाए रखने1. किसी भी तनाव है कि प्लाज्मा झिल्ली अखंडता को नुकसान लाती homeostasis ख़राब हो सकता है, व्यवहार्यता और निषेचन की क्षमता को कम करने, और सेल मौत वृद्धि हुई है । उदाहरण के लिए, cryopreservation अपने प्लाज्मा झिल्ली को नुकसान के कारण शुक्राणु व्यवहार्यता को कम कर देता है, तापमान परिवर्तन और आसमाटिक तनाव2का एक परिणाम के रूप में । हम पहले से बताया कि इस तरह के कीटनाशक atrazine, इसके प्रमुख metabolite diaminochlorotriazine या mycotoxin aflatoxin B1 के रूप में foodborne संदूषणों की कम सांद्रता के लिए बैल शुक्राणु को उजागर, शुक्राणु व्यवहार्यता1,3 कम कर देता है . यह PI, जो एक क्षतिग्रस्त प्लाज्मा झिल्ली के साथ कोशिकाओं के डीएनए को बांध के साथ संयोजन में DAPI के साथ डबल-असहाय डीएनए लेबलिंग द्वारा निर्धारित किया गया था ।
Acrosome प्रतिक्रिया (एआर) बाहरी Acrosome झिल्ली का फ्यूजन और acrosomal एंजाइमों4,5की रिहाई में जिसके परिणामस्वरूप के लिए झूठ प्लाज्मा झिल्ली शामिल है । ये zona-pellucida पैठ के लिए आवश्यक घटनाओं और oocyte6के साथ शुक्राणु के आगे विलय कर रहे हैं । इसलिए, acrosomal झिल्ली अखंडता का मूल्यांकन वीर्य की गुणवत्ता और पुरुष प्रजननता7,8,9का मूल्यांकन करने के लिए एक उपयोगी पैरामीटर का गठन किया । कई फ्लोरोसेंट तकनीक acrosome अखंडता, FITC-ॄणा या FITC-8पीएसए,10के सत्यापन के लिए उपयुक्त हैं । हमारे पिछले अध्ययनों में, FITC के पैटर्न का उपयोग कर-1,3धुंधला, हम (i) बरकरार acrosome के लिए सही परिभाषा प्रदान की, (ii) क्षतिग्रस्त acrosome झिल्ली और (iii) acrosome प्रतिक्रिया व्यक्त की है । वर्तमान रिपोर्ट में, हम शुक्राणु-समर्पित प्रवाह cytometry का उपयोग करके acrosome स्थिति का मूल्यांकन करते हैं और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने वाले परिणामों की तुलना करते हैं.
mitochondria बहुआयामी organelles में शामिल हैं, अन्य बातों के अलावा, एटीपी संश्लेषण, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन, कैल्शियम संकेतन और apoptosis. शारीरिक रोग, पुरुष और महिला बांझपन सहित, बदल mitochondrial समारोह11के साथ जुड़े रहे हैं । शुक्राणु mitochondria midpiece में व्यवस्थित कर रहे है और शुक्राणु गतिशीलता12में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । यह अच्छी तरह से स्वीकार किया है कि उच्च mitochondrial झिल्ली क्षमता (ΔΨm) सामांय गतिशीलता और उच्च निषेचन क्षमता13के साथ जुड़ा हुआ है । इसके विपरीत, कम ΔΨm प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों और कम निषेचन दर14के एक उच्च स्तर के साथ जुड़ा हुआ है । फिर भी, विभिंन पर्यावरणीय यौगिकों, उदाहरण अंत: स्रावी अवरोधकों के लिए, सेलुलर तनाव पैदा कर सकते है और ΔΨm में एक क्षणिक वृद्धि के लिए नेतृत्व, hyperpolarization1,3, मुक्त कण के उत्पादन में वृद्धि और अंत में, apoptosis15. फ्लोरोसेंट जांच 5, 5 ‘, 6, 6 ‘-टेट्रा-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-1, 1 ‘, 3, 3 ‘-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine आयोडाइड (जे. सी.-1) उदाहरण के लिए जांच करने में सक्षम बनाता है, शुक्राणु foodborne पर ΔΨm विषाक्त पदार्थों के प्रभाव1,3.
मानक spermiograms, शारीरिक और रूपात्मक मानकों के आधार पर, वीर्य की गुणवत्ता की भविष्यवाणी करने के लिए काफी अच्छा नहीं कर रहे हैं । अधिक सटीक तरीके शुक्राणु की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं । यहाँ, हम शुक्राणु झिल्ली के मूल्यांकन के आधार पर sperms गुणवत्ता का निर्धारण करने के लिए दो व्यवहार्य तरीके प्रदान करते हैं: एक साथ विशिष्ट फ्लोरोसेंट जांच और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ धुंधला हो जाना, हमारे अध्ययन में वर्णित1,3 और उन्नत शुक्राणु समर्पित प्रवाह cytometry, हाल ही में हमारी प्रयोगशाला में उपयोग किया है, और पहले से ही दूसरों के द्वारा इस्तेमाल किया जा रहा16,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
शुक्राणु निषेचन की क्षमता कई कारकों पर निर्भर करता है इसकी गुणवत्ता को दर्शाती है । शुक्राणु की एक उच्च एकाग्रता और अत्यधिक उत्तरोत्तर gram शुक्राणु के एक उच्च अनुपात उच्च गुणवत्ता वाले वीर्य पर विचार क…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा “सायन” कृत्रिम गर्भाधान और प्रजनन के लिए इजरायल की कंपनी (Hafetz-Haim, इज़राइल) उनकी मदद और सहयोग के लिए, और साधन सेटअप और प्रशिक्षण के साथ सहायता के लिए सुश्री ली एनए (IMV टेक्नोलॉजीज, L’Aigle, फ्रांस) ।
Materials
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] | Sigma | M1254 | |
| PBS | Sigma | P5493 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Ethanol absolute | Sigma | 64-17-5 | |
| Hemacytometer | Neubauer Germany | hemocytometer | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542 | fluorescent probe |
| PI (propidium iodide ) | Sigma | P4170 | fluorescent probe |
| FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) | Sigma | L0770 | fluorescent probe |
| JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) | ENZOBiochem, New York, NY, USA | ENZ52304 | fluorescent probe |
| Annexin V conjugated to FITC | MACS, Miltenyi Biotec | 130-093-060 | fluorescent probe |
| Annexin V binding buffer 20X stock solution | MACS, Miltenyi Biotec | 130-092-820 | buffer |
| Nikon Eclipse, TE-2000-u | Nikon, Tokyo, Japan | inverted fluorescence microscope | |
| Nis Elements | Nikon, Tokyo, Japan | software | |
| Nikon DXM1200F | Nikon, Tokyo, Japan | digital camera | |
| Guava EasyCyte Plus | IMV Technologies, L'Aigle, France | microcapillary sperm flow cytometer | |
| CytoSoft | Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies | software | |
| Buffered solution for cytometry | IMV Technologies, L'Aigle, France | 023862 | buffer |
| Viability and concentration kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024708 | kit for viability assessment |
| Mitochondrial activity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024864 | kit for mitochondrial activity assessment |
| Viability & acrosome integrity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 025293 | kit for acrosome integrity assessment |
| JMP-13 | SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA | software | |
| Bovine sperm | "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel |
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