בקנה מידה גדול פרוטאומיקס מלמעלה למטה באמצעות ספקטרומטר מסה של טנדם אלקטרופורזה של אזור נים
Summary
פרוטוקול מפורט מתואר את ההפרדה, זיהוי של אפיון proteoforms דגימות חלבון באמצעות נימי אזור אלקטרופורזה-ספקטרומטריית electrospray יינון-טנדם ספקטרומטר מסה (CZE-ESI-MS/MS). הפרוטוקול יכול לשמש עבור אפיון ברזולוציה גבוהה proteoforms דגימות חלבון וזיהוי בקנה מידה גדול של proteoforms בדגימות פרוטאום מורכבים.
Abstract
אזור נימי אלקטרופורזה-ספקטרומטריית electrospray יינון-טנדם ספקטרומטר מסה (CZE-ESI-MS/MS) הוכרה ככלי שימושי פרוטאומיקס מלמעלה שמטרתו לאפיין proteoforms ב proteomes מורכבים. עם זאת, היישום של CZE-MS/MS עבור פרוטאומיקס מלמעלה בקנה מידה גדול לו היה מובן את קיבולת טעינה הדגימה נמוך וצר ההפרדה, חלון CZE. כאן, פרוטוקול מתואר באמצעות CZE-MS/MS עם נפח העמסה מדגם בקנה מידה microliter וחלון הפרדה 90-מין עבור פרוטאומיקס מלמעלה בקנה מידה גדול. פלטפורמת CZE-MS/MS מתבסס על לינאריות לזיהוי (LPA)-נימי בתזרים electroosmotic נמוך ביותר, שיטה ריכוז מדגם דינאמיים המבוססות על pH-צומת באינטרנט עם יעילות גבוהה של חלבון בערימה, מצופה ההפרדה ממשק זרימה CE-MS נדן שאוב אלקטרו-kinetically עם רגישות גבוהה מאוד, ספקטרומטר מסה של מלכודת יונים עם גבוה המונית, רזולוציה, מהירות הסריקה. פלטפורמת יכול לשמש האפיון ברזולוציה גבוהה של חלבון שלם פשוט דוגמאות ואפיון בקנה מידה גדול של proteoforms ב proteomes מורכבים שונים. כדוגמה, הוא הפגין הפרדה יעילה במיוחד של תערובת חלבונים רגיל, של זיהוי רגישה מאוד זיהומים רבים באמצעות הפלטפורמה. כדוגמה נוספת, פלטפורמה זו יכול לייצר מעל 500 proteoform ולהפעיל ההזדהויות חלבון 190 מ פרוטאום Escherichia coli ב יחיד CZE-MS/MS.
Introduction
פרוטאומיקס מלמעלה למטה (TDP) שואפת אפיון proteoforms בתוך פרוטאום בקנה מידה גדול. TDP מסתמך על ההפרדה שלב נוזלי יעיל של חלבונים שלמים לפני ניתוח יינון-טנדם ספקטרומטר מסה (ESI-MS/MS) ספקטרומטריית electrospray בשל המורכבות גבוהה של טווח דינמי ריכוז גדול של פרוטאום1,2 ,3,4,5. אזור נימי אלקטרופורזה (CZE) היא טכניקה חזקה עבור הפרדת מולקולות המבוססת על יחסי גודל לתשלום שלהם6. CZE היא יחסית פשוטה, הדורשים בלבד פתוח צינורי התמזגו סיליקה נימי, על רקע אלקטרוליט (BGE), ספק כוח. מדגם של חלבונים שלמים ניתן לטעון לתוך נימי באמצעות לחץ או מתח, ההפרדה הוא שיזם הטבעית בשני קצוות נימי ב BGE ויישום של מתח גבוה. CZE יכולים לגשת יעילות הפרדה גבוהה במיוחד (> לוחות תיאורטי מיליון) דוגל בהפרדה בין מולקולות7. CZE-MS יש רגישות גבוהה יותר באופן משמעותי מאשר בשימוש נרחב כרומטוגרפיה נוזלית הפוך-פאזי (RPLC)-MS לניתוח של חלבונים שלמים8. למרות CZE-MS יש פוטנציאל גדול עבור בקנה מידה גדול מלמעלה פרוטאומיקס, היישום שלה רחב ב פרוטאומיקס יש כבר מובן מספר בעיות, כולל מדגם נמוך-העמסה חלון צר ההפרדה. המדגם טיפוסי טעינת אמצעי אחסון ב- CZE הוא כ 1% מהנפח נימי הכולל, המתאים לרוב פחות מ- 100 nL9,10,11. החלון ההפרדה של CZE הוא בדרך כלל פחות מ 30 דקות בשל9,זרימה (EOF)10electroosmotic חזק. בעיות אלה מגבילות CZE-MS/MS לצורך זיהוי מספר רב של proteoforms ו- proteoforms שופע נמוך מ פרוטאום מורכבים.
הרבה מאמץ כדי לשפר את הדגימה טעינת אמצעי אחסון מהשיטות CZE באמצעות דגימת מקוון ריכוז (למשל, מוצק-שלב microextraction [SPME]12,13, דגימה משופרת שדה הערימה [פס]9 , 11 , 14, ו pH דינמי צומת15,16,17,18). פס ו pH דינמי צומת הם פשוט יותר מאשר SPME, רק לדרוש הבדל משמעותי בין המאגר מדגם BGE את מוליכות, pH. פס מעסיקה מאגר מדגם עם הרבה מוליכות נמוכה יותר מאשר BGE, שמוביל הערמה של analytes על גבול בין אזור הדגימה את אזור BGE נימי. צומת ה-pH דינמי מנצל פקק מדגם בסיסיים (למשל, 50 מ מ אמוניום ביקרבונט, pH 8), של BGE חומצי (למשל, חומצה אצטית 5% [וי/v], pH 2.4) משני הצדדים של התקע הדגימה. בעת יישום של מתח חיובי גבוה בסוף הזרקה נים, טיטור של התקע מדגם basic מתרחש, תוך התמקדות את analytes לתוך פקק חזק לפני שעברו פרידה CZE. לאחרונה, הקבוצה השמש באופן שיטתי לעומת פס ו- pH דינמי צומת על הערימה מקוון של חלבונים שלמים, הפגינו בצומת pH הדינמי הזה יכול להפיק ביצועים טובים הרבה יותר פס עבור ריכוז חלבונים שלמים באינטרנט כאשר האחסון הזרקה מדגם היה 25% הנפח נימי הכולל19.
יש כבר מועסקים ההפרדה נייטרליים מצופה נימים (למשל, לינאריות לזיהוי [LPA]) כדי להפחית EOF ב נימי, מאטים את ההפרדה CZE והרחבת ההפרדה חלון20,21. הקבוצה Dovichi פותח לאחרונה הליך פשוט להכנת ציפוי LPA יציב על הקיר הפנימי של נימים, ניצול קירור (APS) בתור יוזם ומפתח טמפרטורה (50 ° C) ייצור רדיקלים חופשיים, הפילמור22 . ממש לאחרונה, הקבוצה השמש מועסקים נימי ההפרדה מצופים LPA ושיטת צומת pH דינמי עבור CZE הפרדת חלבונים שלמים, להגיע מדגם בקנה מידה microliter טעינת החלון 90-מין הפרדה19ונפח. מערכת זו CZE פותח את הדלת בפני משתמש CZE-MS/MS פרוטאומיקס מלמעלה בקנה מידה גדול.
CZE-MS דורש ממשק רגיש ועמיד מאוד לזוג CZE ל MS. שלושה ממשקים CE-MS כבר מפותחת היטב ממוסחר בהיסטוריה של CE-MS, והם נדן-זרימה co-צירית ממשק23, הממשק sheathless באמצעות טיפ נקבובי כמו פולט ESI24, ו אלקטרו-kinetically נדן שאוב לזרום ממשק25,26. אלקטרו-kinetically שאוב נדן-ממשק-מבוססות זרימה CZE-MS/MS הגיעה למגבלה9זיהוי פפטיד zeptomole נמוך, ההזדהויות פפטיד מעל 10,000 (IDs) של הלה התא פרוטאום יחיד להפעיל14, אפיון מהר של חלבונים שלמים11ולאחר ניתוחים לשחזור ויציבה מאוד של מולקולות26. לאחרונה, את נימי ההפרדה מצופים LPA השיטה צומת pH דינמי, הממשק זרימה נדן אלקטרו-kinetically שאוב שימשו פרוטאומיקס מלמעלה בקנה מידה גדול של פרוטאום Escherichia coli (e. coli)19 ,27. פלטפורמת CZE-MS/MS התקרב יותר מ-500 חתימות proteoform יחיד להפעיל19 ו כמעט 6,000 proteoform מזהים באמצעות מצמד עם גודל-הדרה כרומטוגרפיה (שניות)-RPLC fractionation27. התוצאות מראות בבירור את היכולת של CZE-MS/MS עבור פרוטאומיקס מלמעלה בקנה מידה גדול.
במסמך זה, מתואר הליך מפורט של שימוש CZE-MS/MS עבור פרוטאומיקס מלמעלה בקנה מידה גדול. מערכת CZE-MS/MS מעסיקה את נימי מצופים LPA להפחית EOF בנימי, שיטת צומת pH דינמי עבור ריכוז חלבונים, הממשק זרימה נדן אלקטרו-kinetically שאוב עבור צימוד CZE ל MS, orbitrap מקוון המוני ספקטרומטר עבור האוסף של MS ו- MS/MS ספקטרום של חלבונים ו תוכנת TopPIC (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform זיהוי ואפיון) עבור מזהה proteoform באמצעות חיפוש במסד הנתונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי להשתמש CZE-MS/MS עבור אפיון proteoforms דגימות חלבון ברזולוציה גבוהה, זיהוי בקנה מידה גדול proteoforms בדגימות פרוטאום מורכבים. דיאגרמה של מערכת CZE-ESI-MS/MS מוצג באיור1. ישנם ארבעה שלבים קריטיים בפרוטוקול. ראשית, הכנת ציפוי LPA באיכות גבוהה על הקיר הפנימי של נ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים הקבוצתית של Heedeok הונג-במחלקה לכימיה, אוניברסיטת מישיגן, על בחביבות לספק את התאים Escherichia coli הניסויים. המחברים תודה את התמיכה הלאומית המכון כללי רפואי למדעים, במכון הלאומי של בריאות (NIH) דרך גרנט R01GM118470 (ל X. Liu), R01GM125991 גרנט (כדי ל’ א’ ו- X. Liu).
Materials
| Fused silica capillary | Polymicro Technologies | 1068150017 | 50 µm i.d. 360 µm o.d. |
| Sodium hydroxide pellets | Macron Fine Chemicals | 7708-10 | Corrosive |
| LC-MS grade water | Fisher Scientific | W6-1 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA48-1 | Corrosive |
| Methanol | Fisher Scientific | A456-4 | Toxic, Health Hazard |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M6514 | Moisture and heat sensitive |
| Hydrofluoric acid | Acros Organics | 423805000 | Highy toxic |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic, health hazard |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | Health hazard, Oxidizer |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| Cytochrome C | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Myoglobin | Sigma-Aldrich | M1882 | |
| ß-casein | Sgma-Aldrich | C6905 | |
| Carbonic anhydrase | Sigma-Aldrich | C3934 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Urea | Alfa Aesar | 36428-36 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Health Hazard |
| Iodoacetamide | Fisher Scientific | AC122270250 | Health Hazard |
| Formic Acid | Fisher Scientific | A117-50 | Corrosive, Health Hazard |
| C4 trap column | Sepax Technologies | 110043-4001C | 3 µm particles, 300 Å pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998SK-4 | Toxic, Oxidizer |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 1066-33-7 | |
| Nalgene rapid-flow filters | Thermo Scientific | 126-0020 | 0.2 µm CN membrane, and 50 mm diameter |
| E. coli cells | K-12 MG1655 | ||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23250 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | |
| HPLC system for protein desalting | Agilient | 1260 Infinity II | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| CE autosampler | CMP Scientific | ECE-001 | |
| Electro-kinetically pumped sheath flow interface | CMP Scientific | ||
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sutter flaming/brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Ultrasonic cell disruptor for cell lysis | Branson | 101063196 | Model S-250A |
| Vaccum concentrator | Thermo Fisher Scientific | SPD131DDA-115 |
References
- Aebersold, R., et al. How many proteoforms are there. Nature Chemical Biology. 14 (3), 206-214 (2018).
- Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480 (7376), 254-258 (2011).
- Catherman, A. D., et al. Large-scale Top-down Proteomics of the Human Proteome: Membrane Proteins, Mitochondria, and Senescence. Molecular and Cellular Proteomics. 12 (12), 3465-3473 (2013).
- Cai, W., et al. Top-Down Proteomics of Large Proteins up to 223 kDa Enabled by Serial Size Exclusion Chromatography Strategy. Analytical Chemistry. 89 (10), 5467-5475 (2017).
- Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. Progress in Top-Down Proteomics and the Analysis of Proteoforms. Annual Review of Analytical Chemistry. 9 (1), 499-519 (2016).
- Jorgenson, J. W., Lukacs, K. D. Capillary Zone Electrophoresis. Science. 222 (4621), 266-272 (1983).
- Keithley, R. B. Capillary electrophoresis with three-color fluorescence detection for the analysis of glycosphingolipid metabolism. Analyst. 138 (1), 164-170 (2013).
- Han, X., et al. In-Line Separation by Capillary Electrophoresis Prior to Analysis by Top-Down Mass Spectrometry Enables Sensitive Characterization of Protein Complexes. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6078-6086 (2014).
- Sun, L., Zhu, G., Zhao, Y., Yan, X., Mou, S., Dovichi, N. J. Ultrasensitive and Fast Bottom-up Analysis of Femtogram Amounts of Complex Proteome Digests. Angewandte Chemie International Edition. 52 (51), 13661-13664 (2013).
- Choi, S. B., Lombard-Banek, C., Muñoz-LLancao, P., Manzini, M. C., Nemes, P. Enhanced Peptide Detection Toward Single-Neuron Proteomics by Reversed-Phase Fractionation Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 913-922 (2018).
- Sun, L., Knierman, M. D., Zhu, G., Dovichi, N. J. Fast Top-Down Intact Protein Characterization with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (12), 5989-5995 (2013).
- Wang, Y., Fonslow, B. R., Wong, C. C., Nakorchevsky, A., Yates, J. R. Improving the comprehensiveness and sensitivity of sheathless capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry for proteomic analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8505-8513 (2012).
- Zhang, Z., Yan, X., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Detachable strong cation exchange monolith, integrated with capillary zone electrophoresis and coupled with pH gradient elution, produces improved sensitivity and numbers of peptide identifications during bottom-up analysis of complex proteomes. Analytical Chemistry. 87 (8), 4572-4577 (2015).
- Sun, L., et al. Over 10,000 peptide identifications from the HeLa proteome by using single-shot capillary zone electrophoresis combined with tandem mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition in English. 53 (50), 13931-13933 (2014).
- Aebersold, R., Morrison, H. D. Analysis of dilute peptide samples by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography. 516 (1), 79-88 (1990).
- Britz-McKibbin, P., Chen, D. D. Y. Selective Focusing of Catecholamines and Weakly Acidic Compounds by Capillary Electrophoresis Using a Dynamic pH Junction. Analytical Chemistry. 72 (6), 1242-1252 (2000).
- Zhao, Y., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Coupling Capillary Zone Electrophoresis to a Q Exactive HF Mass Spectrometer for Top-down Proteomics: 580 Proteoform Identifications from Yeast. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3679-3685 (2016).
- Zhu, G., Sun, L., Yan, X., Dovichi, N. J. Bottom-Up Proteomics of Escherichia coli. Using Dynamic pH Junction Preconcentration and Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (13), 6331-6336 (2014).
- Lubeckyj, R. A., McCool, E. N., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. Single-Shot Top-Down Proteomics with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry for Identification of Nearly 600 Escherichia coli Proteoforms. Analytical Chemistry. 89 (22), 12059-12067 (2017).
- Busnel, J. M. High capacity capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry: coupling a porous sheathless interface with transient-isotachophoresis. Analytical Chemistry. 82 (22), 9476-9483 (2010).
- Zhang, Z., Peuchen, E. H., Dovichi, N. J. Surface-Confined Aqueous Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer (SCARAFT) Polymerization Method for Preparation of Coated Capillary Leads to over 10 000 Peptides Identified from 25 ng HeLa Digest by Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 89 (12), 6774-6780 (2017).
- Zhu, G., Sun, L., Dovichi, N. J. Thermally-initiated free radical polymerization for reproducible production of stable linear polyacrylamide coated capillaries, and their application to proteomic analysis using capillary zone electrophoresis-mass spectrometry. Talanta. 146, 839-843 (2016).
- Smith, R. D., Barinaga, C. J., Udseth, H. R. Improved Electrospray Ionization Interface for Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 60 (16), 1948-1952 (1988).
- Moini, M. Simplifying CE-MS Operation. 2. Interfacing Low-Flow Separation Techniques to Mass Spectrometry Using a Porous Tip. Analytical Chemistry. 79 (11), 4241-4246 (2007).
- Wojcik, R., Dada, O. O., Sadilek, M., Dovichi, N. J. Simplified capillary electrophoresis nanospray sheath-flow interface for high efficiency and sensitive peptide analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (17), 2554-2560 (2010).
- Sun, L., Zhu, G., Zhang, Z., Mou, S., Dovichi, N. J. Third-Generation Electrokinetically Pumped Sheath-Flow Nanospray Interface with Improved Stability and Sensitivity for Automated Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry Analysis of Complex Proteome Digests. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).
- McCool, E. N., et al. Deep Top-Down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry: Identification of 5700 Proteoforms from the Eschericia coli Proteome. Analytical Chemistry. 90 (9), 5529-5533 (2018).
- Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
- Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC : a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics. 32 (22), 3495-3497 (2016).
- Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
- Ansong, C., et al. Top-down proteomics reveals a unique protein S-thiolation switch in Salmonella Typhimurium in response to infection-like conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10153-10158 (2013).
- Shen, Y., et al. High-resolution ultrahigh-pressure long column reversed-phase liquid chromatography for top-down proteomics. Journal of Chromatography A. 1498, 99-110 (2017).
- Olsen, J. V., Macek, B., Lange, O., Makarov, A., Horning, S., Mann, M. Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis. Nature Methods. 4 (9), 709-712 (2007).
- Syka, J. E., Coon, J. J., Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (26), 9528-9533 (2004).
- Shaw, J. B., et al. Complete Protein Characterization Using Top-Down Mass Spectrometry and Ultraviolet Photodissociation. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12646-12651 (2013).
