JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

Grootschalige topdown Proteomics met behulp van capillaire Zone elektroforese Tandem massaspectrometrie

Published: October 24, 2018
doi:
10.3791/58644
, , , , ,
1Department of Chemistry,Michigan State University, 2Department of BioHealth Informatics,Indiana University-Purdue University Indianapolis, 3Center for Computational Biology and Bioinformatics,Indiana University School of Medicine

Summary

Een gedetailleerd protocol wordt beschreven voor de scheiding, identificatie en karakterisering van proteoforms in EiwitSteekproeven met behulp van capillaire zone elektroforese-electrospray ionisatie-tandem massaspectrometrie (CZE-ESI-MS/MS). Het protocol kan worden gebruikt voor de hoge-resolutie karakterisatie van proteoforms in simple EiwitSteekproeven en de grootschalige identificatie van proteoforms in complexe Proteoom monsters.

Abstract

Capillaire zone elektroforese-electrospray ionisatie-tandem massaspectrometrie (CZE-ESI-MS/MS) is erkend als een nuttig hulpmiddel voor proteomics van de top-down dat gericht is op het karakteriseren van proteoforms in complexe proteomes. Echter, de toepassing van CZE-MS/MS voor grootschalige topdown proteomics heeft gehinderd door de lage monster-laadvermogen en smalle scheiding venster voor CZE. Een protocol wordt hier beschreven met behulp van CZE-MS/MS met een microliter-schaal monster-laadvolume en een scheiding van de 90-min venster voor grootschalige topdown proteomics. De CZE-MS/MS platform is gebaseerd op een lineaire polyacrylamide (LPA)-gecoate scheiding capillaire met extreem lage electroosmotic flow, een dynamische pH junction-gebaseerde online monster concentratie methode met een hoge efficiëntie voor eiwit stapelen, een Electro-kinetisch gepompt schede stroom CE-MS interface met extreem hoge gevoeligheid en een ion trap massaspectrometer met hoge resolutie massa en scansnelheid. Het platform kan worden gebruikt voor de hoge-resolutie karakterisering van eenvoudige intact EiwitSteekproeven en de grootschalige karakterisatie van proteoforms in diverse complexe proteomes. Als voorbeeld, wordt een zeer efficiënte scheiding van een mengsel van standaard eiwit en een zeer gevoelige detectie van veel onzuiverheden met behulp van het platform gedemonstreerd. Als een ander voorbeeld, dit platform kan produceren meer dan 500 proteoform en 190 eiwit identificaties van een Escherichia coli -Proteoom bij een enkele CZE-MS/MS uitvoeren.

Introduction

Topdown proteomics (TDP) streeft naar de grootschalige karakterisatie van proteoforms binnen een Proteoom. TDP hangt af van de effectieve scheiding van vloeistof-fase van intacte eiwitten vóór electrospray ionisatie-tandem massaspectrometrie (ESI-MS/MS) analyse als gevolg van de hoge complexiteit en dynamisch bereik van de hoge concentratie van de Proteoom1,2 ,3,4,5. Capillaire zone elektroforese (CZE) is een krachtige techniek voor de scheiding van biomoleculen, op basis van hun grootte-naar-charge ratio’s6. CZE is relatief eenvoudig, waarbij alleen een open tubular-gesmolten siliciumdioxide capillaire, een achtergrond elektrolyt (BGE), en een voeding. Een steekproef van intacte eiwitten in het capillair met behulp van druk of spanning kan worden geladen en scheiding wordt geïnitieerd door de beide uiteinden van het capillair in de BGE onder te dompelen en het toepassen van een hoogspanning. CZE ultra-hoge scheidingsrendement kunt benaderen (> 1 miljoen theoretische schotels) voor de scheiding van biomoleculen7. CZE-MS heeft een drastisch hogere gevoeligheid dan gebruikte reversed-phase vloeistofchromatografie (RPLC)-MS voor de analyse van intacte eiwitten8. Hoewel CZE-MS een groot potentieel voor grootschalige topdown proteomics heeft, heeft de brede toepassing ervan in proteomics is belemmerd door verschillende problemen, waaronder een lage monster-laadvermogen en de smalle scheiding venster. Het typische monster laden volume in CZE is ongeveer 1% van het totale capillaire volume, dat normaalgesproken overeenkomt met minder dan 100 nL9,10,11. Het venster van de scheiding van CZE is meestal minder dan 30 min als gevolg van de sterke electroosmotic stroom (EOF)9,10. Deze kwesties beperken de CZE-MS/MS voor de identificatie van een groot aantal proteoforms en lage overvloedige proteoforms van een complexe Proteoom.

Veel moeite heeft gedaan om te verbeteren het monster volume van CZE via online monster concentratie-methoden (bijvoorbeeld, solid-phase microextraction [SPME]12,13, veld versterkte monster stapelen [FESS]9 laden , 11 , 14, en dynamische pH junction15,16,17,18). FESS en dynamische pH junction zijn eenvoudiger dan SPME, alleen vereisen een significant verschil tussen de monster-buffer en de BGE in geleidbaarheid en de pH. FESS maakt gebruik van een monster buffer met een veel lagere geleidendheid dan de BGE, wat leidt tot een stapeling van analyten op de grens tussen het monster en de BGE zone in het capillair. Dynamische pH junction maakt gebruik van een fundamentele monster plug (b.v., 50 mM Ammoniumbicarbonaat, pH 8) en een zuur BGE (bijvoorbeeld5% [v/v]-azijnzuur, pH 2.4) aan beide zijden van de stekker van de steekproef. Op verzoek van een hoge positieve spanning aan het einde van de injectie van het capillair titratie van de stekker van de fundamentele monster treedt op, richten de analyten in een strakke plug voor het ondergaan van een scheiding van CZE. Onlangs, de zon groep systematisch t.o.v. FESS en dynamische pH junction voor de online stapeling van intacte eiwitten, aan te tonen dat dynamische pH junction kon produceren veel betere prestaties dan FESS voor de online concentratie van proteïnen toe intact wanneer Het monstervolume injectie was 25% van de totale capillaire volume19.

Neutraal gecoate scheiding haarvaten (bijvoorbeeldlineaire polyacrylamide [LPA]) zijn tewerkgesteld om het EOF in het capillair, vertragen de CZE scheiding en verbreding van de scheiding venster20,21. Onlangs, de Dovichi-groep ontwikkeld een eenvoudige procedure voor de bereiding van stabiele LPA coating op de binnenwand van de haarvaten, gebruik makend van ammoniumnitraat persulfate (APS) als de initiatiefnemer en de temperatuur (50 ° C) voor de productie van vrije radicalen en polymerisatie22 . Zeer onlangs heeft werkzaam de Sun group de capillaire LPA beklede scheiding en de dynamische pH junction methode voor de CZE scheiding van intacte eiwitten, bereiken een microliter-schaal monster laden volume en een scheiding van de 90-min venster19. Dit systeem van CZE opent de deur voor het gebruik van CZE-MS/MS voor grootschalige topdown proteomics.

CZE-MS vereist een zeer robuuste en gevoelige interface aan paar CZE aan MS. Drie CE-MS interfaces zijn goed ontwikkeld en gecommercialiseerd in de geschiedenis van CE-MS, en ze zijn de co-axiale schede-flow interface23, de sheathless-interface met behulp van een poreuze tip als de ESI emitter24, en de electro-kinetisch gepompt schede flow interface25,26. De electro-kinetisch gepompt schede-stroom-interface-gebaseerde CZE-MS/MS heeft een lage zeptomole peptide detectie limiet9bereikt, meer dan 10.000 peptide identificaties (IDs) van de HeLa cellen Proteoom in één lopen14, een snelle karakterisering van intacte eiwitten11, en zeer stabiel en reproduceerbare analyses van biomoleculen26. Onlangs, het capillair LPA beklede scheiding, de dynamische pH junction methode en de electro-kinetisch gepompt schede stroom interface werden gebruikt voor grootschalige topdown proteomics van een proteoom van Escherichia coli (E. coli)19 ,27. De CZE-MS/MS platform benaderd meer dan 500 proteoform-id’s in één19 en bijna 6.000 proteoform IDs via koppeling met grootte-uitsluiting chromatography (SEC)-RPLC fractionering27. De resultaten tonen duidelijk de mogelijkheden van CZE-MS/MS voor grootschalige topdown proteomics.

Hierin wordt een gedetailleerde procedure van het gebruik van CZE-MS/MS voor grootschalige topdown proteomics beschreven. De CZE-MS/MS-systeem maakt gebruik van het LPA beklede capillair om het EOF in het capillair, de dynamische pH junction methode voor de online concentratie van eiwitten, de electro-kinetisch gepompt schede stroom interface voor het koppelen van CZE aan MS, een orbitrap massa spectrometer voor het verzamelen van MS en MS/MS-spectra van eiwitten, en een tof (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform identificatie en karakterisering) software voor proteoform ID via database zoeken.

Protocol

1. bereiding van LPA Coating op de binnenwand van het capillair scheiding Voorbehandeling van het capillair Spoel een gesmolten siliciumdioxide capillair (120 cm in lengte, 50 µm in binnendiameter [id], 360 µm in buitendiameter [od]) achtereenvolgens met 500 µL van 1 M natronloog, gedeïoniseerd water, 1 M zoutzuur, gedeïoniseerd water en LC-MS rang methanol met behulp van een spuitpomp. Droog het capillair met stikstofgas (10 psi, ≥ 12 h) en vul het capillair met 50…

Representative Results

Figuur 1 toont een van de dynamische pH junction-gebaseerde CZE-ESI-MS systeem dat wordt gebruikt in het experiment. Een lange stekker van het monster in een fundamentele buffer wordt geïnjecteerd in een LPA beklede scheiding capillaire gevuld met een zuur BGE. Na het toepassen van hoge spanningen zal I en II, de analyten in de zone van het monster worden geconcentreerd via de dynamische pH junction methode. Om te beoordelen van de prestaties van he…

Discussion

Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van CZE-MS/MS voor de hoge-resolutie karakterisatie van proteoforms in simple EiwitSteekproeven en voor de grootschalige identificatie van proteoforms in complexe Proteoom monsters. Een diagram van de CZE-ESI-MS/MS-systeem is afgebeeld in Figuur 1. Er zijn vier belangrijke stappen in het protocol. Ten eerste, de voorbereiding van hoogwaardige LPA coating op de binnenwand van de capillaire scheiding is uiterst belangrijk. Een capillai…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Heedeok Hong de groep op de afdeling scheikunde, Michigan State University, bedanken de auteurs voor het vriendelijk het verstrekken van de Escherichia coli cellen voor de experimenten. De auteurs bedanken voor de ondersteuning van het National Institute of General Medical Sciences, de National Institutes of Health (NIH) door middel van Grant R01GM118470 (voor X. Liu) en Grant R01GM125991 (L. zon en X. Liu).

Materials

Fused silica capillary Polymicro Technologies 1068150017 50 µm i.d. 360 µm o.d.
Sodium hydroxide pellets Macron Fine Chemicals 7708-10 Corrosive
LC-MS grade water Fisher Scientific W6-1
Hydrochloric acid Fisher Scientific SA48-1 Corrosive
Methanol Fisher Scientific A456-4 Toxic, Health Hazard
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma-Aldrich M6514 Moisture and heat sensitive
Hydrofluoric acid Acros Organics 423805000 Highy toxic
Acrylamide Acros Organics 164855000 Toxic, health hazard
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678 Health hazard, Oxidizer
lysozyme Sigma-Aldrich L6876
Cytochrome C Sigma-Aldrich C7752
Myoglobin Sigma-Aldrich M1882
ß-casein Sgma-Aldrich C6905
Carbonic anhydrase Sigma-Aldrich C3934
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A2153
Urea Alfa Aesar 36428-36
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632 Health Hazard
Iodoacetamide Fisher Scientific AC122270250 Health Hazard
Formic Acid Fisher Scientific A117-50 Corrosive, Health Hazard
C4 trap column Sepax Technologies 110043-4001C 3 µm particles, 300 Å pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long
Acetonitrile Fisher Scientific A998SK-4 Toxic, Oxidizer
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 1066-33-7
Nalgene rapid-flow filters Thermo Scientific 126-0020 0.2 µm CN membrane, and 50 mm diameter
E. coli cells K-12 MG1655
Dulbecco's phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich D8537
BCA assay Thermo Scientific 23250
Acetone Fisher Scientific A11-1
HPLC system for protein desalting Agilient 1260 Infinity II
Acetic Acid Fisher Scientific A38-212
CE autosampler CMP Scientific ECE-001
Electro-kinetically pumped sheath flow interface CMP Scientific
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer Thermo Fisher Scientific
Sutter flaming/brown micropipette puller Sutter Instruments P-1000
Ultrasonic cell disruptor for cell lysis Branson 101063196 Model S-250A
Vaccum concentrator Thermo Fisher Scientific SPD131DDA-115
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aebersold, R., et al. How many proteoforms are there. Nature Chemical Biology. 14 (3), 206-214 (2018).
  2. Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480 (7376), 254-258 (2011).
  3. Catherman, A. D., et al. Large-scale Top-down Proteomics of the Human Proteome: Membrane Proteins, Mitochondria, and Senescence. Molecular and Cellular Proteomics. 12 (12), 3465-3473 (2013).
  4. Cai, W., et al. Top-Down Proteomics of Large Proteins up to 223 kDa Enabled by Serial Size Exclusion Chromatography Strategy. Analytical Chemistry. 89 (10), 5467-5475 (2017).
  5. Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. Progress in Top-Down Proteomics and the Analysis of Proteoforms. Annual Review of Analytical Chemistry. 9 (1), 499-519 (2016).
  6. Jorgenson, J. W., Lukacs, K. D. Capillary Zone Electrophoresis. Science. 222 (4621), 266-272 (1983).
  7. Keithley, R. B. Capillary electrophoresis with three-color fluorescence detection for the analysis of glycosphingolipid metabolism. Analyst. 138 (1), 164-170 (2013).
  8. Han, X., et al. In-Line Separation by Capillary Electrophoresis Prior to Analysis by Top-Down Mass Spectrometry Enables Sensitive Characterization of Protein Complexes. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6078-6086 (2014).
  9. Sun, L., Zhu, G., Zhao, Y., Yan, X., Mou, S., Dovichi, N. J. Ultrasensitive and Fast Bottom-up Analysis of Femtogram Amounts of Complex Proteome Digests. Angewandte Chemie International Edition. 52 (51), 13661-13664 (2013).
  10. Choi, S. B., Lombard-Banek, C., Muñoz-LLancao, P., Manzini, M. C., Nemes, P. Enhanced Peptide Detection Toward Single-Neuron Proteomics by Reversed-Phase Fractionation Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 913-922 (2018).
  11. Sun, L., Knierman, M. D., Zhu, G., Dovichi, N. J. Fast Top-Down Intact Protein Characterization with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (12), 5989-5995 (2013).
  12. Wang, Y., Fonslow, B. R., Wong, C. C., Nakorchevsky, A., Yates, J. R. Improving the comprehensiveness and sensitivity of sheathless capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry for proteomic analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8505-8513 (2012).
  13. Zhang, Z., Yan, X., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Detachable strong cation exchange monolith, integrated with capillary zone electrophoresis and coupled with pH gradient elution, produces improved sensitivity and numbers of peptide identifications during bottom-up analysis of complex proteomes. Analytical Chemistry. 87 (8), 4572-4577 (2015).
  14. Sun, L., et al. Over 10,000 peptide identifications from the HeLa proteome by using single-shot capillary zone electrophoresis combined with tandem mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition in English. 53 (50), 13931-13933 (2014).
  15. Aebersold, R., Morrison, H. D. Analysis of dilute peptide samples by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography. 516 (1), 79-88 (1990).
  16. Britz-McKibbin, P., Chen, D. D. Y. Selective Focusing of Catecholamines and Weakly Acidic Compounds by Capillary Electrophoresis Using a Dynamic pH Junction. Analytical Chemistry. 72 (6), 1242-1252 (2000).
  17. Zhao, Y., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Coupling Capillary Zone Electrophoresis to a Q Exactive HF Mass Spectrometer for Top-down Proteomics: 580 Proteoform Identifications from Yeast. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3679-3685 (2016).
  18. Zhu, G., Sun, L., Yan, X., Dovichi, N. J. Bottom-Up Proteomics of Escherichia coli. Using Dynamic pH Junction Preconcentration and Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (13), 6331-6336 (2014).
  19. Lubeckyj, R. A., McCool, E. N., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. Single-Shot Top-Down Proteomics with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry for Identification of Nearly 600 Escherichia coli Proteoforms. Analytical Chemistry. 89 (22), 12059-12067 (2017).
  20. Busnel, J. M. High capacity capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry: coupling a porous sheathless interface with transient-isotachophoresis. Analytical Chemistry. 82 (22), 9476-9483 (2010).
  21. Zhang, Z., Peuchen, E. H., Dovichi, N. J. Surface-Confined Aqueous Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer (SCARAFT) Polymerization Method for Preparation of Coated Capillary Leads to over 10 000 Peptides Identified from 25 ng HeLa Digest by Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 89 (12), 6774-6780 (2017).
  22. Zhu, G., Sun, L., Dovichi, N. J. Thermally-initiated free radical polymerization for reproducible production of stable linear polyacrylamide coated capillaries, and their application to proteomic analysis using capillary zone electrophoresis-mass spectrometry. Talanta. 146, 839-843 (2016).
  23. Smith, R. D., Barinaga, C. J., Udseth, H. R. Improved Electrospray Ionization Interface for Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 60 (16), 1948-1952 (1988).
  24. Moini, M. Simplifying CE-MS Operation. 2. Interfacing Low-Flow Separation Techniques to Mass Spectrometry Using a Porous Tip. Analytical Chemistry. 79 (11), 4241-4246 (2007).
  25. Wojcik, R., Dada, O. O., Sadilek, M., Dovichi, N. J. Simplified capillary electrophoresis nanospray sheath-flow interface for high efficiency and sensitive peptide analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (17), 2554-2560 (2010).
  26. Sun, L., Zhu, G., Zhang, Z., Mou, S., Dovichi, N. J. Third-Generation Electrokinetically Pumped Sheath-Flow Nanospray Interface with Improved Stability and Sensitivity for Automated Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry Analysis of Complex Proteome Digests. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).
  27. McCool, E. N., et al. Deep Top-Down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry: Identification of 5700 Proteoforms from the Eschericia coli Proteome. Analytical Chemistry. 90 (9), 5529-5533 (2018).
  28. Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
  29. Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC : a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics. 32 (22), 3495-3497 (2016).
  30. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
  31. Ansong, C., et al. Top-down proteomics reveals a unique protein S-thiolation switch in Salmonella Typhimurium in response to infection-like conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10153-10158 (2013).
  32. Shen, Y., et al. High-resolution ultrahigh-pressure long column reversed-phase liquid chromatography for top-down proteomics. Journal of Chromatography A. 1498, 99-110 (2017).
  33. Olsen, J. V., Macek, B., Lange, O., Makarov, A., Horning, S., Mann, M. Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis. Nature Methods. 4 (9), 709-712 (2007).
  34. Syka, J. E., Coon, J. J., Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (26), 9528-9533 (2004).
  35. Shaw, J. B., et al. Complete Protein Characterization Using Top-Down Mass Spectrometry and Ultraviolet Photodissociation. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12646-12651 (2013).

Tags

ProteomicsCapillary Zone ElectrophoresisMass SpectrometryProtein IsoformsProtein Post-translational ModificationsSample PreparationCapillary CoatingCapillary EtchingCZE System Setup
check_url/58644?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
McCool, E. N., Lubeckyj, R., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (140), e58644, doi:10.3791/58644 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image