Een gedetailleerd protocol wordt beschreven voor de scheiding, identificatie en karakterisering van proteoforms in EiwitSteekproeven met behulp van capillaire zone elektroforese-electrospray ionisatie-tandem massaspectrometrie (CZE-ESI-MS/MS). Het protocol kan worden gebruikt voor de hoge-resolutie karakterisatie van proteoforms in simple EiwitSteekproeven en de grootschalige identificatie van proteoforms in complexe Proteoom monsters.
Capillaire zone elektroforese-electrospray ionisatie-tandem massaspectrometrie (CZE-ESI-MS/MS) is erkend als een nuttig hulpmiddel voor proteomics van de top-down dat gericht is op het karakteriseren van proteoforms in complexe proteomes. Echter, de toepassing van CZE-MS/MS voor grootschalige topdown proteomics heeft gehinderd door de lage monster-laadvermogen en smalle scheiding venster voor CZE. Een protocol wordt hier beschreven met behulp van CZE-MS/MS met een microliter-schaal monster-laadvolume en een scheiding van de 90-min venster voor grootschalige topdown proteomics. De CZE-MS/MS platform is gebaseerd op een lineaire polyacrylamide (LPA)-gecoate scheiding capillaire met extreem lage electroosmotic flow, een dynamische pH junction-gebaseerde online monster concentratie methode met een hoge efficiëntie voor eiwit stapelen, een Electro-kinetisch gepompt schede stroom CE-MS interface met extreem hoge gevoeligheid en een ion trap massaspectrometer met hoge resolutie massa en scansnelheid. Het platform kan worden gebruikt voor de hoge-resolutie karakterisering van eenvoudige intact EiwitSteekproeven en de grootschalige karakterisatie van proteoforms in diverse complexe proteomes. Als voorbeeld, wordt een zeer efficiënte scheiding van een mengsel van standaard eiwit en een zeer gevoelige detectie van veel onzuiverheden met behulp van het platform gedemonstreerd. Als een ander voorbeeld, dit platform kan produceren meer dan 500 proteoform en 190 eiwit identificaties van een Escherichia coli -Proteoom bij een enkele CZE-MS/MS uitvoeren.
Topdown proteomics (TDP) streeft naar de grootschalige karakterisatie van proteoforms binnen een Proteoom. TDP hangt af van de effectieve scheiding van vloeistof-fase van intacte eiwitten vóór electrospray ionisatie-tandem massaspectrometrie (ESI-MS/MS) analyse als gevolg van de hoge complexiteit en dynamisch bereik van de hoge concentratie van de Proteoom1,2 ,3,4,5. Capillaire zone elektroforese (CZE) is een krachtige techniek voor de scheiding van biomoleculen, op basis van hun grootte-naar-charge ratio’s6. CZE is relatief eenvoudig, waarbij alleen een open tubular-gesmolten siliciumdioxide capillaire, een achtergrond elektrolyt (BGE), en een voeding. Een steekproef van intacte eiwitten in het capillair met behulp van druk of spanning kan worden geladen en scheiding wordt geïnitieerd door de beide uiteinden van het capillair in de BGE onder te dompelen en het toepassen van een hoogspanning. CZE ultra-hoge scheidingsrendement kunt benaderen (> 1 miljoen theoretische schotels) voor de scheiding van biomoleculen7. CZE-MS heeft een drastisch hogere gevoeligheid dan gebruikte reversed-phase vloeistofchromatografie (RPLC)-MS voor de analyse van intacte eiwitten8. Hoewel CZE-MS een groot potentieel voor grootschalige topdown proteomics heeft, heeft de brede toepassing ervan in proteomics is belemmerd door verschillende problemen, waaronder een lage monster-laadvermogen en de smalle scheiding venster. Het typische monster laden volume in CZE is ongeveer 1% van het totale capillaire volume, dat normaalgesproken overeenkomt met minder dan 100 nL9,10,11. Het venster van de scheiding van CZE is meestal minder dan 30 min als gevolg van de sterke electroosmotic stroom (EOF)9,10. Deze kwesties beperken de CZE-MS/MS voor de identificatie van een groot aantal proteoforms en lage overvloedige proteoforms van een complexe Proteoom.
Veel moeite heeft gedaan om te verbeteren het monster volume van CZE via online monster concentratie-methoden (bijvoorbeeld, solid-phase microextraction [SPME]12,13, veld versterkte monster stapelen [FESS]9 laden , 11 , 14, en dynamische pH junction15,16,17,18). FESS en dynamische pH junction zijn eenvoudiger dan SPME, alleen vereisen een significant verschil tussen de monster-buffer en de BGE in geleidbaarheid en de pH. FESS maakt gebruik van een monster buffer met een veel lagere geleidendheid dan de BGE, wat leidt tot een stapeling van analyten op de grens tussen het monster en de BGE zone in het capillair. Dynamische pH junction maakt gebruik van een fundamentele monster plug (b.v., 50 mM Ammoniumbicarbonaat, pH 8) en een zuur BGE (bijvoorbeeld5% [v/v]-azijnzuur, pH 2.4) aan beide zijden van de stekker van de steekproef. Op verzoek van een hoge positieve spanning aan het einde van de injectie van het capillair titratie van de stekker van de fundamentele monster treedt op, richten de analyten in een strakke plug voor het ondergaan van een scheiding van CZE. Onlangs, de zon groep systematisch t.o.v. FESS en dynamische pH junction voor de online stapeling van intacte eiwitten, aan te tonen dat dynamische pH junction kon produceren veel betere prestaties dan FESS voor de online concentratie van proteïnen toe intact wanneer Het monstervolume injectie was 25% van de totale capillaire volume19.
Neutraal gecoate scheiding haarvaten (bijvoorbeeldlineaire polyacrylamide [LPA]) zijn tewerkgesteld om het EOF in het capillair, vertragen de CZE scheiding en verbreding van de scheiding venster20,21. Onlangs, de Dovichi-groep ontwikkeld een eenvoudige procedure voor de bereiding van stabiele LPA coating op de binnenwand van de haarvaten, gebruik makend van ammoniumnitraat persulfate (APS) als de initiatiefnemer en de temperatuur (50 ° C) voor de productie van vrije radicalen en polymerisatie22 . Zeer onlangs heeft werkzaam de Sun group de capillaire LPA beklede scheiding en de dynamische pH junction methode voor de CZE scheiding van intacte eiwitten, bereiken een microliter-schaal monster laden volume en een scheiding van de 90-min venster19. Dit systeem van CZE opent de deur voor het gebruik van CZE-MS/MS voor grootschalige topdown proteomics.
CZE-MS vereist een zeer robuuste en gevoelige interface aan paar CZE aan MS. Drie CE-MS interfaces zijn goed ontwikkeld en gecommercialiseerd in de geschiedenis van CE-MS, en ze zijn de co-axiale schede-flow interface23, de sheathless-interface met behulp van een poreuze tip als de ESI emitter24, en de electro-kinetisch gepompt schede flow interface25,26. De electro-kinetisch gepompt schede-stroom-interface-gebaseerde CZE-MS/MS heeft een lage zeptomole peptide detectie limiet9bereikt, meer dan 10.000 peptide identificaties (IDs) van de HeLa cellen Proteoom in één lopen14, een snelle karakterisering van intacte eiwitten11, en zeer stabiel en reproduceerbare analyses van biomoleculen26. Onlangs, het capillair LPA beklede scheiding, de dynamische pH junction methode en de electro-kinetisch gepompt schede stroom interface werden gebruikt voor grootschalige topdown proteomics van een proteoom van Escherichia coli (E. coli)19 ,27. De CZE-MS/MS platform benaderd meer dan 500 proteoform-id’s in één19 en bijna 6.000 proteoform IDs via koppeling met grootte-uitsluiting chromatography (SEC)-RPLC fractionering27. De resultaten tonen duidelijk de mogelijkheden van CZE-MS/MS voor grootschalige topdown proteomics.
Hierin wordt een gedetailleerde procedure van het gebruik van CZE-MS/MS voor grootschalige topdown proteomics beschreven. De CZE-MS/MS-systeem maakt gebruik van het LPA beklede capillair om het EOF in het capillair, de dynamische pH junction methode voor de online concentratie van eiwitten, de electro-kinetisch gepompt schede stroom interface voor het koppelen van CZE aan MS, een orbitrap massa spectrometer voor het verzamelen van MS en MS/MS-spectra van eiwitten, en een tof (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform identificatie en karakterisering) software voor proteoform ID via database zoeken.
Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van CZE-MS/MS voor de hoge-resolutie karakterisatie van proteoforms in simple EiwitSteekproeven en voor de grootschalige identificatie van proteoforms in complexe Proteoom monsters. Een diagram van de CZE-ESI-MS/MS-systeem is afgebeeld in Figuur 1. Er zijn vier belangrijke stappen in het protocol. Ten eerste, de voorbereiding van hoogwaardige LPA coating op de binnenwand van de capillaire scheiding is uiterst belangrijk. Een capillai…
The authors have nothing to disclose.
Heedeok Hong de groep op de afdeling scheikunde, Michigan State University, bedanken de auteurs voor het vriendelijk het verstrekken van de Escherichia coli cellen voor de experimenten. De auteurs bedanken voor de ondersteuning van het National Institute of General Medical Sciences, de National Institutes of Health (NIH) door middel van Grant R01GM118470 (voor X. Liu) en Grant R01GM125991 (L. zon en X. Liu).
Fused silica capillary | Polymicro Technologies | 1068150017 | 50 µm i.d. 360 µm o.d. |
Sodium hydroxide pellets | Macron Fine Chemicals | 7708-10 | Corrosive |
LC-MS grade water | Fisher Scientific | W6-1 | |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA48-1 | Corrosive |
Methanol | Fisher Scientific | A456-4 | Toxic, Health Hazard |
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M6514 | Moisture and heat sensitive |
Hydrofluoric acid | Acros Organics | 423805000 | Highy toxic |
Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic, health hazard |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | Health hazard, Oxidizer |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
Cytochrome C | Sigma-Aldrich | C7752 | |
Myoglobin | Sigma-Aldrich | M1882 | |
ß-casein | Sgma-Aldrich | C6905 | |
Carbonic anhydrase | Sigma-Aldrich | C3934 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
Urea | Alfa Aesar | 36428-36 | |
DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Health Hazard |
Iodoacetamide | Fisher Scientific | AC122270250 | Health Hazard |
Formic Acid | Fisher Scientific | A117-50 | Corrosive, Health Hazard |
C4 trap column | Sepax Technologies | 110043-4001C | 3 µm particles, 300 Å pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long |
Acetonitrile | Fisher Scientific | A998SK-4 | Toxic, Oxidizer |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 1066-33-7 | |
Nalgene rapid-flow filters | Thermo Scientific | 126-0020 | 0.2 µm CN membrane, and 50 mm diameter |
E. coli cells | K-12 MG1655 | ||
Dulbecco's phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
BCA assay | Thermo Scientific | 23250 | |
Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | |
HPLC system for protein desalting | Agilient | 1260 Infinity II | |
Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
CE autosampler | CMP Scientific | ECE-001 | |
Electro-kinetically pumped sheath flow interface | CMP Scientific | ||
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
Sutter flaming/brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
Ultrasonic cell disruptor for cell lysis | Branson | 101063196 | Model S-250A |
Vaccum concentrator | Thermo Fisher Scientific | SPD131DDA-115 |