자세한 프로토콜 분리, 식별 및 모 세관 지역 전기 이동 법-분무 이온화 탠덤 질량 분석 (CZE-ESI-MS/MS)를 사용 하 여 단백질 샘플에서 proteoforms의 특성에 대 한 설명 합니다. 프로토콜은 단순 단백질 샘플에서 proteoforms의 고해상도 특성화 및 복잡 한 프로테옴 샘플에서 proteoforms의 대규모 식별에 사용할 수 있습니다.
모 세관 지역 전기 이동 법-분무 이온화 탠덤 질량 분석 (CZE-ESI-MS/MS) 복잡 한 proteomes에 proteoforms 하는 것을 목표로 내려 proteomics에 대 한 유용한 도구로 인정 받고 있습니다. 그러나, 대규모 내려 proteomics CZE-MS/MS의 응용 프로그램 낮은 샘플 로드 용량에 의해 장애가 되었습니다 고 분리 창 CZE의 좁은. 여기, 프로토콜 대규모 내려 proteomics microliter 규모 샘플 로드 볼륨과 90 분 분리 창 CZE-MS/MS를 사용 하 여 설명 합니다. CZE-MS/MS 플랫폼 기반으로 선형 polyacrylamide (LPA)-매우 낮은 electroosmotic 교류, 단백질 스태킹에 대 한 높은 효율으로 동적 pH 접합-기반 온라인 샘플 농도 방법으로 모 세관 코팅된 분리는 펌핑된 운동 전기 칼 흐름 CE MS 인터페이스 매우 높은 감도 높은 이온 트랩 질량 분석기 대량 해상도 스캔 속도. 플랫폼은 간단한 그대로 단백질 샘플의 고해상도 특성화 및 다양 한 복잡 한 proteomes에서 proteoforms의 대규모 특성에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 표준 단백질 혼합물의 고효율 분리 및 플랫폼을 사용 하 여 많은 불순물의 매우 민감한 검출은 설명 했다. 또 다른 예로,이 플랫폼은 500 proteoform를 생성할 수 있습니다 하 고 단일 CZE-MS/MS에는 대장균 의 프로테옴에서 190 단백질 식별 실행 합니다.
탑-다운 proteomics (TDP) proteoforms는 프로테옴 내 대규모 특성에 대 한 목표로 한다. TDP에 높은 복잡성 때문에 분무 이온화 탠덤 질량 분석 (ESI-MS/MS) 분석 하기 전에 본래 단백질의 효과적인 액체 상 분리 및 프로테옴1,2의 큰 농도 동적 범위 사용 ,3,,45. 모 세관 지역 전기 이동 법 (CZE) 그들의 크기에 충전 비율6에 따라 생체의 분리에 대 한 강력한 기술입니다. CZE만 있는 오픈 관 융합 된 실리 카 모 세관, 배경 전해질 (BGE) 및 전원 공급 장치 요구는 상대적으로 간단 하다. 그대로 단백질의 샘플은 모 세관 압력 또는 전압를 사용 하 여 로드할 수 그리고 분리는 BGE에 모 세관의 양쪽 끝을 immersing 높은 전압을 적용 하 여 시작 됩니다. CZE 매우 높은 분리 효율을 접근할 수 있다 (> 1 백만 이론적 접시) 생체7의 분리에 대 한. CZE MS는 널리 사용 되는 반전 단계 액체 크로마토그래피 (RPLC) 보다 크게 높은 감도-그대로 단백질8의 분석에 대 한 MS. CZE MS 대규모 내려 proteomics에 대 한 큰 잠재력이 있다, 하지만 proteomics에 넓은 응용 프로그램 낮은 샘플 로드 용량, 좁은 분리 창 등 여러 문제로 장애가 되어 있다. CZE에 볼륨을 로드 하는 일반적인 샘플은 보통 100 미만 nL9,10,11에 해당 총 모 세관 볼륨의 약 1%입니다. CZE의 분리 창 일반적으로 강한 electroosmotic 교류 (EOF)9,10인 미만 30 분입니다. 이러한 문제는 CZE-MS/MS proteoforms 및 복잡 한 프로테옴에서 낮은 풍부한 proteoforms의 많은 수의 식별에 대 한 제한.
CZE 통해 온라인 샘플 농도 방법 (예를 들어, 고체 상 미 [SPME]12,13, 필드 강화 된 샘플 스택 [자 백]9 의 볼륨을 로드 하는 예제를 개선 하기 위해 많은 노력이 했다 , 11 , 14, 그리고 동적 pH 접속점15,16,,1718). 자 백 및 동적 pH 접합 SPME만 전도성 및 pH에 샘플 버퍼와는 BGE 사이의 중요 한 차이 요구 보다 간단 하 게 있습니다. 자 백 샘플 영역 및 모 세관에서 BGE 영역 사이 경계에 analytes의 스태킹 이끌어 BGE 보다 훨씬 더 낮은 전도도와 샘플 버퍼를 사용 합니다. 동적 pH 접합 기본적인 샘플 플러그인 (예, 50mm 염화 중 탄산염, pH 8) 샘플 플러그의 양쪽에는 산 성 BGE (예를 들어, [v] 5% 초 산, pH 2.4)을 활용합니다. 모 세관의 주입 후에 높은 긍정적인 전압의 응용 프로그램에 따라 기본적인 샘플 플러그인의 적정, CZE 분리를 겪고 전에 꽉 플러그에는 analytes을 집중 발생 합니다. 최근, 태양 그룹 체계적으로 비교 자 백 및 동적 pH 접합 그대로 단백질의 온라인 스태킹에 대 한 그 동적 pH 접합 그대로 단백질의 온라인 농도 대 한 자 백 보다 훨씬 더 나은 성능을 생산할 수 있는 시연 때 샘플 주입 볼륨 총 모 세관 볼륨19의 25% 이었다.
중립으로 코팅된 분리 모세 혈관 (예를 들어, 선형 polyacrylamide [LPA])을 줄이기 위해 감속 CZE 분리 하 고 분리 창20,21확대는 모 세관에서 EOF 고용 있다. 최근, Dovichi 그룹 개발, 모세 혈관의 내부 벽에 안정적인 LPA 코팅의 준비에 대 한 간단한 절차 암모늄 persulfate (AP)를 활용 하 여 시작자 및 자유 래 디 칼 생산 및 합22에 대 한 온도 (50 ℃) . 아주 최근에, 태양 그룹 고용 모 세관 LPA 코팅 분리 및 동적 pH 접합 방법 그대로 단백질, CZE 분리에 대 한 로드 볼륨 및 90 분 분리 창19microliter 규모 샘플에 도달. 이 CZE 시스템 대규모 내려 proteomics에 대 한 CZE-MS/MS를 사용 하 여 문을 엽니다.
CZE MS 몇 ms CZE 매우 강력 하 고 중요 한 인터페이스를 필요합니다. 3 CE MS 인터페이스 잘 개발 하 고 상용화 CE-MS의 역사에 있었고 그들은 co-칼 집 기류 인터페이스23, ESI 미터24, 다공성 팁을 사용 하 여 sheathless 인터페이스와 전기 접착 펌핑된 칼 집 인터페이스25,26흐름. 전기 접착 펌핑된 칼 집-흐름-인터페이스 기반 CZE-MS/MS는 낮은 zeptomole 펩 티 드의 탐지 한계9에 도달 했습니다, 그리고 10000 이상의 펩 티 드 식별 (Id)는 헬러에서14, 빠른 특성화를 실행 하는 단일에서 프로테옴 그대로 단백질11, 및 생체26의 매우 안정적이 고 재현 가능한 분석. 최근, LPA 코팅 분리 모 세관, 동적 pH 접합 방법 및 전기 접착 펌핑된 칼 흐름 인터페이스는 대장균 (대장균) 프로테옴19의 대규모 내려 proteomics에 사용 되었다 ,27. CZE-MS/MS 플랫폼 접근 500 proteoform Id19 고 거의 6000 proteoform Id를 통해 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)와 커플링을 실행 하는 단일-RPLC 분별 법27. 결과 명확 하 게 대규모 내려 proteomics CZE-MS/MS의 기능을 보여준다.
여기, CZE-MS/MS를 사용 하 여 대규모 내려 proteomics에 대 한 자세한 절차는 설명 되어 있습니다. CZE-MS/MS 시스템 사용을 줄이기 위해 모 세관, 단백질, ms, 한 orbitrap CZE 커플링에 대 한 펌핑된 운동 전기 칼 흐름 인터페이스의 온라인 농도 대 한 동적 pH 접합 방법에에서 EOF LPA 코팅 모 세관 질량 단백질, 및 proteoform ID 통해 데이터베이스 검색에 대 한 TopPIC (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform 식별 및 특성화) 소프트웨어의 MS 및 MS/MS 스펙트럼의 컬렉션에 대 한 분석기.
여기 우리는 간단한 단백질 샘플에서 proteoforms의 고해상도 특성 및 복잡 한 프로테옴 샘플에서 proteoforms의 대규모 식별 CZE-MS/MS를 사용 하 여 상세한 프로토콜을 제공 합니다. CZE-ESI-MS/MS 시스템의 다이어그램은 그림 1에 표시 됩니다. 프로토콜에는 4 개의 중요 한 단계가 있습니다. 첫째, 분리 모 세관의 안 벽에 높은-품질 LPA 코팅의 준비는 매우 중요 하다. LPA 코팅 분리 모 세?…
The authors have nothing to disclose.
저자 친절 하 게 제공 대장균 세포 실험을 위한 미시간 주립 대학, 화학과에서 Heedeok 홍의 그룹을 감사 합니다. 저자 (L. Sun X. Liu)를 일반 의료 과학의 국립 연구소, 국립 보건원의 건강 (NIH) 그랜트 R01GM118470 (X. Liu)을 통해 부여 R01GM125991에서 지원을 감사합니다.
Fused silica capillary | Polymicro Technologies | 1068150017 | 50 µm i.d. 360 µm o.d. |
Sodium hydroxide pellets | Macron Fine Chemicals | 7708-10 | Corrosive |
LC-MS grade water | Fisher Scientific | W6-1 | |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA48-1 | Corrosive |
Methanol | Fisher Scientific | A456-4 | Toxic, Health Hazard |
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M6514 | Moisture and heat sensitive |
Hydrofluoric acid | Acros Organics | 423805000 | Highy toxic |
Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic, health hazard |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | Health hazard, Oxidizer |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
Cytochrome C | Sigma-Aldrich | C7752 | |
Myoglobin | Sigma-Aldrich | M1882 | |
ß-casein | Sgma-Aldrich | C6905 | |
Carbonic anhydrase | Sigma-Aldrich | C3934 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
Urea | Alfa Aesar | 36428-36 | |
DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Health Hazard |
Iodoacetamide | Fisher Scientific | AC122270250 | Health Hazard |
Formic Acid | Fisher Scientific | A117-50 | Corrosive, Health Hazard |
C4 trap column | Sepax Technologies | 110043-4001C | 3 µm particles, 300 Å pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long |
Acetonitrile | Fisher Scientific | A998SK-4 | Toxic, Oxidizer |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 1066-33-7 | |
Nalgene rapid-flow filters | Thermo Scientific | 126-0020 | 0.2 µm CN membrane, and 50 mm diameter |
E. coli cells | K-12 MG1655 | ||
Dulbecco's phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
BCA assay | Thermo Scientific | 23250 | |
Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | |
HPLC system for protein desalting | Agilient | 1260 Infinity II | |
Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
CE autosampler | CMP Scientific | ECE-001 | |
Electro-kinetically pumped sheath flow interface | CMP Scientific | ||
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
Sutter flaming/brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
Ultrasonic cell disruptor for cell lysis | Branson | 101063196 | Model S-250A |
Vaccum concentrator | Thermo Fisher Scientific | SPD131DDA-115 |