모 세관 지역 전기 이동 법 탠덤 질량 분석을 사용 하 여 대규모 하향식 단백질

Summary

자세한 프로토콜 분리, 식별 및 모 세관 지역 전기 이동 법-분무 이온화 탠덤 질량 분석 (CZE-ESI-MS/MS)를 사용 하 여 단백질 샘플에서 proteoforms의 특성에 대 한 설명 합니다. 프로토콜은 단순 단백질 샘플에서 proteoforms의 고해상도 특성화 및 복잡 한 프로테옴 샘플에서 proteoforms의 대규모 식별에 사용할 수 있습니다.

Abstract

모 세관 지역 전기 이동 법-분무 이온화 탠덤 질량 분석 (CZE-ESI-MS/MS) 복잡 한 proteomes에 proteoforms 하는 것을 목표로 내려 proteomics에 대 한 유용한 도구로 인정 받고 있습니다. 그러나, 대규모 내려 proteomics CZE-MS/MS의 응용 프로그램 낮은 샘플 로드 용량에 의해 장애가 되었습니다 고 분리 창 CZE의 좁은. 여기, 프로토콜 대규모 내려 proteomics microliter 규모 샘플 로드 볼륨과 90 분 분리 창 CZE-MS/MS를 사용 하 여 설명 합니다. CZE-MS/MS 플랫폼 기반으로 선형 polyacrylamide (LPA)-매우 낮은 electroosmotic 교류, 단백질 스태킹에 대 한 높은 효율으로 동적 pH 접합-기반 온라인 샘플 농도 방법으로 모 세관 코팅된 분리는 펌핑된 운동 전기 칼 흐름 CE MS 인터페이스 매우 높은 감도 높은 이온 트랩 질량 분석기 대량 해상도 스캔 속도. 플랫폼은 간단한 그대로 단백질 샘플의 고해상도 특성화 및 다양 한 복잡 한 proteomes에서 proteoforms의 대규모 특성에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 표준 단백질 혼합물의 고효율 분리 및 플랫폼을 사용 하 여 많은 불순물의 매우 민감한 검출은 설명 했다. 또 다른 예로,이 플랫폼은 500 proteoform를 생성할 수 있습니다 하 고 단일 CZE-MS/MS에는 대장균 의 프로테옴에서 190 단백질 식별 실행 합니다.

Introduction

탑-다운 proteomics (TDP) proteoforms는 프로테옴 내 대규모 특성에 대 한 목표로 한다. TDP에 높은 복잡성 때문에 분무 이온화 탠덤 질량 분석 (ESI-MS/MS) 분석 하기 전에 본래 단백질의 효과적인 액체 상 분리 및 프로테옴^{1,2의 큰 농도 동적 범위 사용 ,3,,45}. 모 세관 지역 전기 이동 법 (CZE) 그들의 크기에 충전 비율⁶에 따라 생체의 분리에 대 한 강력한 기술입니다. CZE만 있는 오픈 관 융합 된 실리 카 모 세관, 배경 전해질 (BGE) 및 전원 공급 장치 요구는 상대적으로 간단 하다. 그대로 단백질의 샘플은 모 세관 압력 또는 전압를 사용 하 여 로드할 수 그리고 분리는 BGE에 모 세관의 양쪽 끝을 immersing 높은 전압을 적용 하 여 시작 됩니다. CZE 매우 높은 분리 효율을 접근할 수 있다 (> 1 백만 이론적 접시) 생체⁷의 분리에 대 한. CZE MS는 널리 사용 되는 반전 단계 액체 크로마토그래피 (RPLC) 보다 크게 높은 감도-그대로 단백질⁸의 분석에 대 한 MS. CZE MS 대규모 내려 proteomics에 대 한 큰 잠재력이 있다, 하지만 proteomics에 넓은 응용 프로그램 낮은 샘플 로드 용량, 좁은 분리 창 등 여러 문제로 장애가 되어 있다. CZE에 볼륨을 로드 하는 일반적인 샘플은 보통 100 미만 nL^9,10,11에 해당 총 모 세관 볼륨의 약 1%입니다. CZE의 분리 창 일반적으로 강한 electroosmotic 교류 (EOF)^9,10인 미만 30 분입니다. 이러한 문제는 CZE-MS/MS proteoforms 및 복잡 한 프로테옴에서 낮은 풍부한 proteoforms의 많은 수의 식별에 대 한 제한.

CZE 통해 온라인 샘플 농도 방법 (예를 들어, 고체 상 미 [SPME]^12,13, 필드 강화 된 샘플 스택 [자 백]⁹ 의 볼륨을 로드 하는 예제를 개선 하기 위해 많은 노력이 했다 ^{, 11 , 14}, 그리고 동적 pH 접속점^15,16,,1718). 자 백 및 동적 pH 접합 SPME만 전도성 및 pH에 샘플 버퍼와는 BGE 사이의 중요 한 차이 요구 보다 간단 하 게 있습니다. 자 백 샘플 영역 및 모 세관에서 BGE 영역 사이 경계에 analytes의 스태킹 이끌어 BGE 보다 훨씬 더 낮은 전도도와 샘플 버퍼를 사용 합니다. 동적 pH 접합 기본적인 샘플 플러그인 (예, 50mm 염화 중 탄산염, pH 8) 샘플 플러그의 양쪽에는 산 성 BGE (예를 들어, [v] 5% 초 산, pH 2.4)을 활용합니다. 모 세관의 주입 후에 높은 긍정적인 전압의 응용 프로그램에 따라 기본적인 샘플 플러그인의 적정, CZE 분리를 겪고 전에 꽉 플러그에는 analytes을 집중 발생 합니다. 최근, 태양 그룹 체계적으로 비교 자 백 및 동적 pH 접합 그대로 단백질의 온라인 스태킹에 대 한 그 동적 pH 접합 그대로 단백질의 온라인 농도 대 한 자 백 보다 훨씬 더 나은 성능을 생산할 수 있는 시연 때 샘플 주입 볼륨 총 모 세관 볼륨¹⁹의 25% 이었다.

중립으로 코팅된 분리 모세 혈관 (예를 들어, 선형 polyacrylamide [LPA])을 줄이기 위해 감속 CZE 분리 하 고 분리 창^20,21확대는 모 세관에서 EOF 고용 있다. 최근, Dovichi 그룹 개발, 모세 혈관의 내부 벽에 안정적인 LPA 코팅의 준비에 대 한 간단한 절차 암모늄 persulfate (AP)를 활용 하 여 시작자 및 자유 래 디 칼 생산 및 합^{22에 대 한 온도 (50 ℃)} . 아주 최근에, 태양 그룹 고용 모 세관 LPA 코팅 분리 및 동적 pH 접합 방법 그대로 단백질, CZE 분리에 대 한 로드 볼륨 및 90 분 분리 창¹⁹microliter 규모 샘플에 도달. 이 CZE 시스템 대규모 내려 proteomics에 대 한 CZE-MS/MS를 사용 하 여 문을 엽니다.

CZE MS 몇 ms CZE 매우 강력 하 고 중요 한 인터페이스를 필요합니다. 3 CE MS 인터페이스 잘 개발 하 고 상용화 CE-MS의 역사에 있었고 그들은 co-칼 집 기류 인터페이스²³, ESI 미터²⁴, 다공성 팁을 사용 하 여 sheathless 인터페이스와 전기 접착 펌핑된 칼 집 인터페이스^25,26흐름. 전기 접착 펌핑된 칼 집-흐름-인터페이스 기반 CZE-MS/MS는 낮은 zeptomole 펩 티 드의 탐지 한계⁹에 도달 했습니다, 그리고 10000 이상의 펩 티 드 식별 (Id)는 헬러에서¹⁴, 빠른 특성화를 실행 하는 단일에서 프로테옴 그대로 단백질¹¹, 및 생체²⁶의 매우 안정적이 고 재현 가능한 분석. 최근, LPA 코팅 분리 모 세관, 동적 pH 접합 방법 및 전기 접착 펌핑된 칼 흐름 인터페이스는 대장균 (대장균) 프로테옴^{19의 대규모 내려 proteomics에 사용 되었다 ,27}. CZE-MS/MS 플랫폼 접근 500 proteoform Id¹⁹ 고 거의 6000 proteoform Id를 통해 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)와 커플링을 실행 하는 단일-RPLC 분별 법²⁷. 결과 명확 하 게 대규모 내려 proteomics CZE-MS/MS의 기능을 보여준다.

여기, CZE-MS/MS를 사용 하 여 대규모 내려 proteomics에 대 한 자세한 절차는 설명 되어 있습니다. CZE-MS/MS 시스템 사용을 줄이기 위해 모 세관, 단백질, ms, 한 orbitrap CZE 커플링에 대 한 펌핑된 운동 전기 칼 흐름 인터페이스의 온라인 농도 대 한 동적 pH 접합 방법에에서 EOF LPA 코팅 모 세관 질량 단백질, 및 proteoform ID 통해 데이터베이스 검색에 대 한 TopPIC (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform 식별 및 특성화) 소프트웨어의 MS 및 MS/MS 스펙트럼의 컬렉션에 대 한 분석기.

Protocol

1. 분리 모 세관의 안 벽에 LPA 코팅의 준비 모 세관의 전처리 1 M 수산화 나트륨, 이온된 수, 1 M 염 산, 이온된 수, 및 LC MS 학년 메탄올 주사기 펌프를 사용 하 여 500 µ L로 연속적으로 용융 실리 카 모 세관 (내경 [아이디], [마약] 외경에서 360 µ m에에서 50 µ m, 길이 120cm) 플러시. 질소 가스 (≥ 12 h 10 psi) 모 세관을 건조 하 고 50% (v/v) 3-(trimethoxysilyl)는 모 세관 채우기?…

Representative Results

그림 1 실험에 사용 된 동적 pH 접합-기반 CZE-ESI-MS 시스템의 다이어그램을 보여 줍니다. 기본 버퍼에서 샘플의 긴 플러그는 LPA 코팅 분리 모세는 산 성 BGE 가득에 주입 됩니다. 높은 전압을 적용 한 후 I 및 II, analytes 샘플 영역에 집중을 통해 동적 pH 접합 방법 있을 것입니다. CZE MS 시스템의 성능을 평가 하는 표준 단백질 혼합물 (시 토 크롬 c, lyso…

Discussion

여기 우리는 간단한 단백질 샘플에서 proteoforms의 고해상도 특성 및 복잡 한 프로테옴 샘플에서 proteoforms의 대규모 식별 CZE-MS/MS를 사용 하 여 상세한 프로토콜을 제공 합니다. CZE-ESI-MS/MS 시스템의 다이어그램은 그림 1에 표시 됩니다. 프로토콜에는 4 개의 중요 한 단계가 있습니다. 첫째, 분리 모 세관의 안 벽에 높은-품질 LPA 코팅의 준비는 매우 중요 하다. LPA 코팅 분리 모 세?…

Materials

Fused silica capillary	Polymicro Technologies	1068150017	50 µm i.d. 360 µm o.d.
Sodium hydroxide pellets	Macron Fine Chemicals	7708-10	Corrosive
LC-MS grade water	Fisher Scientific	W6-1
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	SA48-1	Corrosive
Methanol	Fisher Scientific	A456-4	Toxic, Health Hazard
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate	Sigma-Aldrich	M6514	Moisture and heat sensitive
Hydrofluoric acid	Acros Organics	423805000	Highy toxic
Acrylamide	Acros Organics	164855000	Toxic, health hazard
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678	Health hazard, Oxidizer
lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876
Cytochrome C	Sigma-Aldrich	C7752
Myoglobin	Sigma-Aldrich	M1882
ß-casein	Sgma-Aldrich	C6905
Carbonic anhydrase	Sigma-Aldrich	C3934
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Urea	Alfa Aesar	36428-36
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632	Health Hazard
Iodoacetamide	Fisher Scientific	AC122270250	Health Hazard
Formic Acid	Fisher Scientific	A117-50	Corrosive, Health Hazard
C4 trap column	Sepax Technologies	110043-4001C	3 µm particles, 300 Å pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998SK-4	Toxic, Oxidizer
Ammonium bicarbonate	Sigma-Aldrich	1066-33-7
Nalgene rapid-flow filters	Thermo Scientific	126-0020	0.2 µm CN membrane, and 50 mm diameter
E. coli cells			K-12 MG1655
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	D8537
BCA assay	Thermo Scientific	23250
Acetone	Fisher Scientific	A11-1
HPLC system for protein desalting	Agilient	1260 Infinity II
Acetic Acid	Fisher Scientific	A38-212
CE autosampler	CMP Scientific	ECE-001
Electro-kinetically pumped sheath flow interface	CMP Scientific
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer	Thermo Fisher Scientific
Sutter flaming/brown micropipette puller	Sutter Instruments	P-1000
Ultrasonic cell disruptor for cell lysis	Branson	101063196	Model S-250A
Vaccum concentrator	Thermo Fisher Scientific	SPD131DDA-115