बड़े पैमाने पर शीर्ष नीचे प्रोटियोमिक् केशिका जोन का उपयोग कर ट्रो मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री
Summary
एक विस्तृत प्रोटोकॉल जुदाई, पहचान के लिए वर्णित है, और प्रोटीन के नमूनों में proteoforms के लक्षण वर्णन केशिका क्षेत्र ट्रो-electrospray ionization-मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री (CZE-ईएसआई-ms/ प्रोटोकॉल सरल प्रोटीन नमूनों में proteoforms के उच्च संकल्प लक्षण वर्णन और जटिल proteome नमूनों में proteoforms की बड़े पैमाने पर पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Abstract
केशिका जोन ट्रो-electrospray ionization-मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (CZE-ईएसआई-ms/ms) ऊपर-नीचे प्रोटियोमिक् के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में पहचाना गया है जो जटिल proteoforms में proteomes को विशेषता प्रदान करता है । हालांकि, CZE के आवेदन-एमएस/ms के लिए बड़े पैमाने पर ऊपर-नीचे प्रोटियोमिक् कम नमूना-लोडिंग क्षमता और CZE के संकीर्ण जुदाई खिड़की से बाधित किया गया है । यहां, एक प्रोटोकॉल एक microliter पैमाने पर नमूना-लोड हो रहा है वॉल्यूम और बड़े पैमाने पर ऊपर-नीचे प्रोटियोमिक् के लिए एक ९०-ंयूनतम जुदाई खिड़की के साथ CZE-ms/ms का उपयोग कर वर्णन किया गया है । CZE-ms/ms प्लेटफ़ॉर्म एक रेखीय polyacrylamide (LPA) पर आधारित है-अत्यंत कम electroosmotic प्रवाह के साथ लेपित पृथक्करण केशिका, प्रोटीन स्टैकिंग के लिए एक उच्च दक्षता के साथ एक गतिशील पीएच-जंक्शन आधारित ऑनलाइन नमूना एकाग्रता विधि, एक इलेक्ट्रो-काइनेटिक पंप अत्यंत उच्च संवेदनशीलता के साथ म्यान फ्लो CE-एमएस इंटरफेस, और उच्च जन संकल्प और स्कैन गति के साथ एक आयन जाल जन स्पेक्ट्रोमीटर. मंच सरल बरकरार प्रोटीन के नमूनों की उच्च संकल्प लक्षण वर्णन और विभिंन जटिल proteomes में proteoforms के बड़े पैमाने पर लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक उदाहरण के रूप में, एक मानक प्रोटीन मिश्रण का एक अत्यधिक कुशल जुदाई और कई मंच का उपयोग अशुद्धियों का एक अति संवेदनशील पता लगाने का प्रदर्शन किया है । एक अंय उदाहरण के रूप में, इस मंच पर ५०० proteoform और १९० प्रोटीन पहचान एक ई कोलाई proteome से एक एकल CZE में उत्पादन कर सकते है एमएस/
Introduction
ऊपर-नीचे प्रोटियोमिक् (तेदेपा) एक proteome के भीतर proteoforms के बड़े पैमाने पर लक्षण वर्णन के लिए करना है । तेदेपा electrospray ionization से पहले बरकरार प्रोटीन के प्रभावी तरल चरण जुदाई पर निर्भर करता है-मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री (ईएसआई-ms/ms) उच्च जटिलता और बड़ी एकाग्रता proteome1,2 के गतिशील रेंज के कारण विश्लेषण ,3,4,5. केशिका जोन ट्रो (CZE) अपने आकार के लिए चार्ज अनुपात6के आधार पर अपने अणुओं के विभाजन के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है । CZE अपेक्षाकृत सरल है, केवल एक खुले ट्यूबलर से जुड़े सिलिका केशिका, एक पृष्ठभूमि इलेक्ट्रोलाइट (BGE), और एक बिजली की आपूर्ति की आवश्यकता होती है । बरकरार प्रोटीन का एक नमूना केशिका में दबाव या वोल्टेज का उपयोग कर लोड किया जा सकता है, और जुदाई BGE में केशिका के दोनों सिरों को डुबोने और एक उच्च वोल्टेज लागू करने से शुरू की है । CZE अल्ट्रा उच्च जुदाई दक्षता दृष्टिकोण कर सकते है (> १,०००,००० सैद्धांतिक प्लेटें)7अणुओं की जुदाई के लिए । CZE-एमएस एक काफी उच्च संवेदनशीलता है व्यापक रूप से इस्तेमाल किया उलट-चरण तरल क्रोमैटोग्राफी (RPLC)-बरकरार प्रोटीन8के विश्लेषण के लिए एमएस । हालांकि CZE-MS बड़े पैमाने पर ऊपर से नीचे प्रोटियोमिक् के लिए एक महान क्षमता है, प्रोटियोमिक् में अपने विस्तृत आवेदन एक कम नमूना लोड क्षमता और संकीर्ण जुदाई खिड़की सहित कई मुद्दों, द्वारा बाधित किया गया है. CZE में ठेठ नमूना लोड हो रहा है मात्रा के बारे में है 1% कुल केशिका मात्रा, जो आमतौर पर से मेल खाती है से कम करने के लिए १०० nL9,10,11. CZE की जुदाई खिड़की आम तौर पर मजबूत electroosmotic प्रवाह (EOF)9,10के कारण 30 मिनट से भी कम है । इन मुद्दों की सीमा एक जटिल proteome से proteoforms और कम प्रचुर मात्रा में proteoforms की एक बड़ी संख्या की पहचान के लिए CZE-ms/
बहुत प्रयास ऑनलाइन नमूना एकाग्रता तरीकों के माध्यम से CZE की नमूना लोड हो रहा है मात्रा में सुधार करने के लिए किया गया है (जैसे, ठोस चरण microextraction [SPME]12,13, क्षेत्र-बढ़ाया नमूना stacking [FESS]9 , 11 , 14, और गतिशील पीएच जंक्शन15,16,17,18) । FESS और गतिशील पीएच जंक्शन SPME से सरल हैं, केवल नमूना बफर और चालकता और पीएच में BGE के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर की आवश्यकता होती है । FESS BGE की तुलना में बहुत कम चालकता के साथ एक नमूना बफर रोजगार, नमूना क्षेत्र और केशिका में BGE क्षेत्र के बीच सीमा पर analytes के stacking के लिए अग्रणी । गतिशील पीएच जंक्शन नमूना प्लग के दोनों किनारों पर एक बुनियादी नमूना प्लग (उदाहरणके लिए, ५० mM अमोनियम बिकारबोनिट, पीएच 8) और एक अंलीय BGE (जैसे, 5% [v/v] एसिटिक एसिड, पीएच २.४) का इस्तेमाल करता है । एक उच्च सकारात्मक वोल्टेज के आवेदन पर केशिका के इंजेक्शन अंत में, बुनियादी नमूना प्लग के अनुमापन होता है, एक तंग प्लग में एक CZE जुदाई के दौर से गुजर से पहले analytes ध्यान केंद्रित. हाल ही में, सूर्य समूह व्यवस्थित की तुलना में बरकरार प्रोटीन की ऑनलाइन stacking के लिए FESS और गतिशील पीएच जंक्शन, प्रदर्शन है कि गतिशील पीएच जंक्शन बरकरार प्रोटीन की ऑनलाइन एकाग्रता के लिए FESS से ज्यादा बेहतर प्रदर्शन उपज सकता है जब नमूना इंजेक्शन की मात्रा कुल केशिका मात्रा19का 25% थी ।
तटस्थ रूप से लेपित जुदाई केशिकाओं (जैसे, रैखिक polyacrylamide [LPA]) केशिका में EOF को कम करने के लिए नियोजित किया गया है, नीचे CZE जुदाई धीमा और जुदाई खिड़की20,21को चौड़ा । हाल ही में, Dovichi समूह केशिकाओं की भीतरी दीवार पर स्थिर LPA कोटिंग की तैयारी के लिए एक सरल प्रक्रिया विकसित की है, मुक्त कट्टरपंथी उत्पादन और बहुलकीकरण 22 के लिए शुरुआत और तापमान (५० डिग्री सेल्सियस) के रूप में अमोनियम persulfate (एपीएस) का उपयोग . हाल ही में, सूर्य समूह बरकरार प्रोटीन की CZE जुदाई के लिए LPA लेपित जुदाई केशिका और गतिशील पीएच जंक्शन विधि कार्यरत, एक microliter पैमाने पर नमूना लोड हो रहा है वॉल्यूम और एक ९०-ंयूनतम जुदाई विंडो19तक पहुंचने । इस CZE प्रणाली का उपयोग करने के लिए दरवाजे खोलता है CZE-ms/बड़े पैमाने पर ऊपर-नीचे प्रोटियोमिक् के लिए ms.
CZE-ms एमएस के लिए एक बहुत मजबूत और संवेदनशील जोड़ी CZE के लिए इंटरफेस की आवश्यकता है । तीन ce-एमएस इंटरफेस अच्छी तरह से विकसित किया गया है और ce-ms के इतिहास में व्यावसायिकता, और वे सह-अक्षीय म्यान-प्रवाह इंटरफेस23, के रूप में एक छिद्रित टिप का उपयोग कर रहे हैं, तो म्यान इंटरफ़ेस24, और इलेक्ट्रो-काइनेटिक पंप म्यान प्रवाह इंटरफेस25,26। इलेक्ट्रो-काइनेटिक पंप म्यान-फ्लो-इंटरफेस-आधारित CZE-ms/ms एक कम zeptomole पेप्टाइड पता लगाने की सीमा तक पहुँच गया है9, पर १०,००० पेप्टाइड पहचान (आईडी) से हेला सेल proteome में एक ही रन14, एक तेजी से लक्षण वर्णन बरकरार प्रोटीन की11, और अत्यधिक स्थिर और reproducible विश्लेषण के अणुओं26। हाल ही में, LPA-लेपित जुदाई केशिका, गतिशील पीएच जंक्शन विधि, और इलेक्ट्रो-काइनेटिक पंप म्यान प्रवाह इंटरफेस बड़े पैमाने पर ऊपर-नीचे एक ई कोलाई के प्रोटियोमिक् के लिए इस्तेमाल किया गया (ई. कोलाई) proteome19 ,27. CZE-ms/ms प्लेटफ़ॉर्म एक एकल रन19 और लगभग ६,००० proteoform ids में ५०० proteoform ids आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी)-RPLC अंश27के साथ युग्मन के माध्यम से संपर्क किया । परिणाम स्पष्ट रूप से बड़े पैमाने पर ऊपर-नीचे प्रोटियोमिक् के लिए CZE की क्षमता-ms/
साथ ही, बड़े पैमाने पर टॉप-डाउन प्रोटियोमिक् के लिए CZE-ms/ms का उपयोग करने की विस्तृत प्रक्रिया बताई गई है । CZE-ms/ms प्रणाली केशिका में EOF को कम करने के लिए LPA लेपित केशिका कार्यरत है, प्रोटीन की ऑनलाइन एकाग्रता के लिए गतिशील पीएच जंक्शन विधि, इलेक्ट्रो-काइनेटिक पंप म्यान प्रवाह इंटरफ़ेस के लिए युग्मन CZE के लिए एमएस, एक orbitrap मास एमएस और एमएस के संग्रह के लिए स्पेक्ट्रोमीटर/एमएस स्पेक्ट्रा प्रोटीन की, और एक TopPIC (ऊपर-नीचे मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित Proteoform पहचान और लक्षण वर्णन) डेटाबेस खोज के माध्यम से Proteoform आईडी के लिए सॉफ्टवेयर ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए CZE का उपयोग करें-ms/proteoforms के उच्च संकल्प लक्षण वर्णन के लिए सरल प्रोटीन के नमूनों में और जटिल proteome नमूनों में proteoforms की बड़े पैमाने पर पहचान के लिए एमएस । चित्र <strong…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक रसायन विज्ञान विभाग में Heedeok है हांगकांग समूह धंयवाद, मिशिगन राज्य विश्वविद्यालय, के लिए कृपया प्रयोगों के लिए ई कोलाई कोशिकाओं प्रदान करते हैं । लेखक राष्ट्रीय जनरल चिकित्सा विज्ञान संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (NIH) के माध्यम से अनुदान R01GM118470 (एक्स. लियू के लिए) और अनुदान R01GM125991 (एल सूरज और एक्स. लियू के लिए) से समर्थन का धंयवाद ।
Materials
| Fused silica capillary | Polymicro Technologies | 1068150017 | 50 µm i.d. 360 µm o.d. |
| Sodium hydroxide pellets | Macron Fine Chemicals | 7708-10 | Corrosive |
| LC-MS grade water | Fisher Scientific | W6-1 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA48-1 | Corrosive |
| Methanol | Fisher Scientific | A456-4 | Toxic, Health Hazard |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M6514 | Moisture and heat sensitive |
| Hydrofluoric acid | Acros Organics | 423805000 | Highy toxic |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic, health hazard |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | Health hazard, Oxidizer |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| Cytochrome C | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Myoglobin | Sigma-Aldrich | M1882 | |
| ß-casein | Sgma-Aldrich | C6905 | |
| Carbonic anhydrase | Sigma-Aldrich | C3934 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Urea | Alfa Aesar | 36428-36 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Health Hazard |
| Iodoacetamide | Fisher Scientific | AC122270250 | Health Hazard |
| Formic Acid | Fisher Scientific | A117-50 | Corrosive, Health Hazard |
| C4 trap column | Sepax Technologies | 110043-4001C | 3 µm particles, 300 Å pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998SK-4 | Toxic, Oxidizer |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 1066-33-7 | |
| Nalgene rapid-flow filters | Thermo Scientific | 126-0020 | 0.2 µm CN membrane, and 50 mm diameter |
| E. coli cells | K-12 MG1655 | ||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23250 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | |
| HPLC system for protein desalting | Agilient | 1260 Infinity II | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| CE autosampler | CMP Scientific | ECE-001 | |
| Electro-kinetically pumped sheath flow interface | CMP Scientific | ||
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sutter flaming/brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Ultrasonic cell disruptor for cell lysis | Branson | 101063196 | Model S-250A |
| Vaccum concentrator | Thermo Fisher Scientific | SPD131DDA-115 |
References
- Aebersold, R., et al. How many proteoforms are there. Nature Chemical Biology. 14 (3), 206-214 (2018).
- Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480 (7376), 254-258 (2011).
- Catherman, A. D., et al. Large-scale Top-down Proteomics of the Human Proteome: Membrane Proteins, Mitochondria, and Senescence. Molecular and Cellular Proteomics. 12 (12), 3465-3473 (2013).
- Cai, W., et al. Top-Down Proteomics of Large Proteins up to 223 kDa Enabled by Serial Size Exclusion Chromatography Strategy. Analytical Chemistry. 89 (10), 5467-5475 (2017).
- Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. Progress in Top-Down Proteomics and the Analysis of Proteoforms. Annual Review of Analytical Chemistry. 9 (1), 499-519 (2016).
- Jorgenson, J. W., Lukacs, K. D. Capillary Zone Electrophoresis. Science. 222 (4621), 266-272 (1983).
- Keithley, R. B. Capillary electrophoresis with three-color fluorescence detection for the analysis of glycosphingolipid metabolism. Analyst. 138 (1), 164-170 (2013).
- Han, X., et al. In-Line Separation by Capillary Electrophoresis Prior to Analysis by Top-Down Mass Spectrometry Enables Sensitive Characterization of Protein Complexes. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6078-6086 (2014).
- Sun, L., Zhu, G., Zhao, Y., Yan, X., Mou, S., Dovichi, N. J. Ultrasensitive and Fast Bottom-up Analysis of Femtogram Amounts of Complex Proteome Digests. Angewandte Chemie International Edition. 52 (51), 13661-13664 (2013).
- Choi, S. B., Lombard-Banek, C., Muñoz-LLancao, P., Manzini, M. C., Nemes, P. Enhanced Peptide Detection Toward Single-Neuron Proteomics by Reversed-Phase Fractionation Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 913-922 (2018).
- Sun, L., Knierman, M. D., Zhu, G., Dovichi, N. J. Fast Top-Down Intact Protein Characterization with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (12), 5989-5995 (2013).
- Wang, Y., Fonslow, B. R., Wong, C. C., Nakorchevsky, A., Yates, J. R. Improving the comprehensiveness and sensitivity of sheathless capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry for proteomic analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8505-8513 (2012).
- Zhang, Z., Yan, X., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Detachable strong cation exchange monolith, integrated with capillary zone electrophoresis and coupled with pH gradient elution, produces improved sensitivity and numbers of peptide identifications during bottom-up analysis of complex proteomes. Analytical Chemistry. 87 (8), 4572-4577 (2015).
- Sun, L., et al. Over 10,000 peptide identifications from the HeLa proteome by using single-shot capillary zone electrophoresis combined with tandem mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition in English. 53 (50), 13931-13933 (2014).
- Aebersold, R., Morrison, H. D. Analysis of dilute peptide samples by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography. 516 (1), 79-88 (1990).
- Britz-McKibbin, P., Chen, D. D. Y. Selective Focusing of Catecholamines and Weakly Acidic Compounds by Capillary Electrophoresis Using a Dynamic pH Junction. Analytical Chemistry. 72 (6), 1242-1252 (2000).
- Zhao, Y., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Coupling Capillary Zone Electrophoresis to a Q Exactive HF Mass Spectrometer for Top-down Proteomics: 580 Proteoform Identifications from Yeast. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3679-3685 (2016).
- Zhu, G., Sun, L., Yan, X., Dovichi, N. J. Bottom-Up Proteomics of Escherichia coli. Using Dynamic pH Junction Preconcentration and Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (13), 6331-6336 (2014).
- Lubeckyj, R. A., McCool, E. N., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. Single-Shot Top-Down Proteomics with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry for Identification of Nearly 600 Escherichia coli Proteoforms. Analytical Chemistry. 89 (22), 12059-12067 (2017).
- Busnel, J. M. High capacity capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry: coupling a porous sheathless interface with transient-isotachophoresis. Analytical Chemistry. 82 (22), 9476-9483 (2010).
- Zhang, Z., Peuchen, E. H., Dovichi, N. J. Surface-Confined Aqueous Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer (SCARAFT) Polymerization Method for Preparation of Coated Capillary Leads to over 10 000 Peptides Identified from 25 ng HeLa Digest by Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 89 (12), 6774-6780 (2017).
- Zhu, G., Sun, L., Dovichi, N. J. Thermally-initiated free radical polymerization for reproducible production of stable linear polyacrylamide coated capillaries, and their application to proteomic analysis using capillary zone electrophoresis-mass spectrometry. Talanta. 146, 839-843 (2016).
- Smith, R. D., Barinaga, C. J., Udseth, H. R. Improved Electrospray Ionization Interface for Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 60 (16), 1948-1952 (1988).
- Moini, M. Simplifying CE-MS Operation. 2. Interfacing Low-Flow Separation Techniques to Mass Spectrometry Using a Porous Tip. Analytical Chemistry. 79 (11), 4241-4246 (2007).
- Wojcik, R., Dada, O. O., Sadilek, M., Dovichi, N. J. Simplified capillary electrophoresis nanospray sheath-flow interface for high efficiency and sensitive peptide analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (17), 2554-2560 (2010).
- Sun, L., Zhu, G., Zhang, Z., Mou, S., Dovichi, N. J. Third-Generation Electrokinetically Pumped Sheath-Flow Nanospray Interface with Improved Stability and Sensitivity for Automated Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry Analysis of Complex Proteome Digests. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).
- McCool, E. N., et al. Deep Top-Down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry: Identification of 5700 Proteoforms from the Eschericia coli Proteome. Analytical Chemistry. 90 (9), 5529-5533 (2018).
- Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
- Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC : a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics. 32 (22), 3495-3497 (2016).
- Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
- Ansong, C., et al. Top-down proteomics reveals a unique protein S-thiolation switch in Salmonella Typhimurium in response to infection-like conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10153-10158 (2013).
- Shen, Y., et al. High-resolution ultrahigh-pressure long column reversed-phase liquid chromatography for top-down proteomics. Journal of Chromatography A. 1498, 99-110 (2017).
- Olsen, J. V., Macek, B., Lange, O., Makarov, A., Horning, S., Mann, M. Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis. Nature Methods. 4 (9), 709-712 (2007).
- Syka, J. E., Coon, J. J., Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (26), 9528-9533 (2004).
- Shaw, J. B., et al. Complete Protein Characterization Using Top-Down Mass Spectrometry and Ultraviolet Photodissociation. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12646-12651 (2013).
