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Summary
胁迫位点是参与各种生理过程的一个小的神经元簇。在这里, 我们描述了一个方案, 准备小鼠大脑部分, 用于研究蛋白质和金属在这个细胞核。
Abstract
逼位点 (lc) 是去甲肾上腺素产生神经元的主要枢纽, 调节许多生理功能。lc 的结构或功能异常会影响几个大脑区域, 包括皮层、海马和小脑, 并可能导致抑郁、双相情感障碍、焦虑以及帕金森病和阿尔茨海默病。这些疾病通常与金属失平衡有关, 但金属在 lc 中的作用只被部分理解。需要对 lc 进行形态和功能研究, 以更好地了解人体病理和金属的贡献。小鼠是一种广泛使用的实验模型, 但小鼠 lc 体积小 (直径约 0.3 mm), 对于非专家来说很难识别。在这里, 我们描述了一个逐步免疫组织化学为基础的协议, 以本地化在小鼠大脑中的 lc。多巴胺-β-羟化酶 (dbh), 或者酪氨酸羟化酶 (th), 这两种酶在 lc 中高度表达, 被用作大脑切片的免疫组织化学标志物。与含 lc 切片相邻的部分可用于进一步分析, 包括用于形态学研究的组织学、代谢检测以及 x 射线荧光显微镜 (xfm) 的金属成像。
Introduction
费鲁厄斯 (lc) 位点 (lc) 是脑干的一个重要区域, 也是去甲肾上腺素 (ne) 产生的主要部位1。lc 将整个大脑2的投影发送到皮层、海马体和小脑3 , 并调节主要的生理过程, 包括生理节律4,5, 注意力和记忆6,压力7, 认知过程8, 和情绪9,10。lc 功能障碍与神经和神经精神障碍有 11例, 包括帕金森病 12、13、14、阿尔茨海默病14、抑郁症15 16,17, 双相情感障碍18,19,焦虑20,21, 22,23,24. 鉴于这些作用, 对 lc 的分析对于研究其功能和功能障碍至关重要。
小鼠被广泛用于生理和病理生理过程的研究。由于体积小, 小鼠 lc 的平均直径约为 300μm, 因此难以定位结构。在脑切片过程中, lc 很容易在冠状或矢状切片中丢失。现有的研究描述了 lc 在动物中的识别没有提供一个分步的协议, 一个非专家可以遵循1,25。因此, 为了提供 lc 本地化的指导, 我们描述了一个协议, 我们开发的协议在多个应用程序的鼠标大脑中定位此区域 (图 1, 图 2, 图 3)。该方案应用精心控制的脑切片和免疫组织化学检测 dbh26,27, 或交替 th24, 这两种酶在 lc28中高度富集。一旦 lc 通过免疫组织化学定位, 相邻的大脑切片可用于进一步的研究, 包括形态学和代谢分析, 以及通过 x 射线荧光显微镜 (xfm)29进行金属成像研究。我们将 xfm 描述为本协议中的一个示例 (图 3)。
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Protocol
约翰·霍普金斯大学动物护理和使用 (acuc) 议定书编号 m017m385 批准了对动物的研究。
1. 脑切片
- 为了固定, 用3% 异氟醚麻醉小鼠。
- 用异氟醚滴浸泡棉球, 并将其放入15毫升的微离心管中。将动物的鼻子放入试管中, 让其吸入异氟醚。检查麻醉的深度是否缺乏对脚趾夹紧的反应。
- 将动物放在背部, 并通过用 t 针固定其四肢, 同时进入其腹部, 使其固定。
- 用手术剪刀从腹部皮肤上剪下, 穿过胸部区域的皮肤, 将动物剪断。用 t 针将皮肤固定下来。然后将腹膜膜打破到胸部。通过裂开胸腔和切割横隔膜来暴露心脏。
- 切割右心房, 让血液流出动物。将一个带有25规格针头的10毫升注射器插入左心室, 并用10毫升磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 灌注。
注: 这允许溶液流经全身循环, 并通过右心房退出。 - 取出10毫升注射器, 并将25规格的针头插入到60毫升注射器上。用50毫升冰凉4% 的甲醛 (pfa) 完美地穿过左心室。
- 在 h2o 中稀释10% 的 pfa 溶液, 并在4°c 下冷却最后的 4% pfa 溶液, 从而制备冰凉的 4% pfa 溶液。
- 隔离鼠标头部, 将大脑从头骨中取出。
- 从脖子上割下来, 然后朝眼睛切, 露出头骨。把头骨从脖子打到鼻子, 然后从一个眼球打到另一个眼球。把头骨剥掉, 切除整个大脑。
- 在4°c 条件下, 用 4% pfa 将大脑培养24小时。
- 用钳子将大脑转移到一个50毫升的锥形管, 里面装满了25% 的蔗糖溶液。将其保持在 4°c, 直到大脑沉入管底8-72小时。
- 用成年小鼠大脑切片器的基质冠状穿过中脑 (大脑后部约3毫米) 切割大脑。保持大脑部分包含脑干。
注: 这将导致两个大脑部分-一个包含大部分的皮层 (前切) 和一个包含脑干/小脑 (后部的切口)。使用脑干部分执行以下步骤。 - 嵌入脑干部分, 切割表面放置在嵌入模具的底部, 周围有最佳的切割温度化合物 (oct);将嵌入的大脑移动到-80°c 的冰柜中, 并冷冻至少 12小时, 直到进一步使用。
- 在低温恒温器处切割: 将 oct 中包含大脑的嵌入模具放入低温恒温器中;在低温恒温器中孵育几个小时, 将大脑阻滞的温度调整到低温恒温器的温度。
- 剥去嵌入模具, 露出包含大脑的 oct 块。
- 使用剃须刀片去除块表面多余的 oct, 而不接触大脑。
- 将 oct 块安装在低温恒温器的卡盘上, 将大脑的切割表面向前部露出。
- 调整大脑的切割表面, 使其与低温恒温器的剃须刀平行定向。
- 从髓质开始修剪大脑, 横切100μm 部分。
- 用茎修剪, 直到小脑和脑干被切割成一个连续的切片。开始收集厚度为50微米的切片。
注: 当一个人从髓质的边缘修剪时, 脑干和小脑将作为两个独立的部分切割。在左心室部分, 脑干和小脑最终将合并在第4脑室的水平。一旦第4脑室的侧缘形成良好, 小脑和脑干就会形成一个连续的切片。- 用钳子收集 oct 周围的大脑切片, 并将其放入一个装满 pbs 的24孔板的井中 (图 2a)。当小脑和下大肠杆菌在 ~-5.52 毫米后部相遇时, lc 将最为突出 (图 1b)。
注: 一旦小脑完全分离, lc 的大部分前部将消失, 不再包围在 ~-5.34 毫米后部的大肠杆菌 (图 1c)。
- 用钳子收集 oct 周围的大脑切片, 并将其放入一个装满 pbs 的24孔板的井中 (图 2a)。当小脑和下大肠杆菌在 ~-5.52 毫米后部相遇时, lc 将最为突出 (图 1b)。
2. 多巴胺β-羟基化酶或酪氨酸羟化酶的免疫组织化学 (图 2)
- 第1天
- 在 pbs 中清洗所选切片三次, 时间为5分钟。
- 在4°c 下, 用洗涤剂 (pbsd) 在0.5% 磷酸盐缓冲盐水中渗透24小时。
- 在25毫升的 pbs 中稀释125μl 洗涤剂。
- 第2天
- 用 0.5% pbsd 将切片洗三次, 用5分钟。
- 在4°c 稀释量为1:500 的情况下, 在0.5% 的 pbsd 中加入原代抗体、抗 dbh 或抗 th 18 小时。
- 第3天
- 用 0.5% pbsd 将切片洗三次, 10分钟。
- 在稀释1:1000 的 0.5% pbsd 16小时内加入所需的二级抗体 (488 驴抗兔用于绿色荧光)。
- 将24孔板包裹在铝中, 并放置在4°c。
- 用 0.5% pbsd 将切片洗三次, 用5分钟。
- 在 pbs 中清洗5分钟。
- 用铅笔刷将切片转移到水容器中。
- 在带电的幻灯片上安装漂浮在水中的切片。
- 带有硬设置安装介质 (不带 dapi) 的盖板部分。
- 在室温下将安装的大脑部分擦干30分钟。
- 图像大脑在共聚焦或荧光显微镜上切片, 设置以检测来自适当的二次抗体荧光波长的信号。
- 将显微镜调整到大脑切片的焦平面, 并以10倍的放大倍率拍摄一张图像。
- 要在脑切片中定位可能的 lc 区域, 请使用第4脑室进行定向;小脑位于脑室上方, 脑垂体和脑干位于30 以下。
- 要定位 lc, 请聚焦在第4脑室的侧向边缘;lc 起源于第4脑室的边缘 , 指向小臂/脑干区域 (图 2b, 2b)。
- 在某些脑片中对 lc 进行成像和定位后, 将包含脑片的幻灯片存储在4°c。
3. 脑片中 lc 的检测
- 要找到包含 lc 的大脑部分, 请按上述方法对鼠标大脑进行切片, 并在 pbs 中收集填充24个井盘的部分, 如图2a 所示。
- 每个井放置一个大脑部分, 以便正确定位 lc。
- 收集总共48片的大脑切片, 这些切片将被免疫抑制每个大脑。
注:图 2a所示的两个菜的所有水井都含有一种动物的脑片。 - 免疫注射每三到第五片的 dbh, 或 th。优选地, 对那些与进一步检测的脑片相邻的大脑切片进行免疫组织化学 (通过 x 射线荧光显微镜, xfm)。
注: 此过程允许 lc 在最终的检测切片中精确定位 (图 2a; 标记为井间的数字)。 - 根据应用情况调整免疫抑制的大脑切片的数量,例如, 它们是否需要 lc 中心和边缘的确切位置, 或者只是粗略的近似值。
- 在免疫组织化学之后, 通过在第4脑室两侧的典型表达模式检测含有 lc 的脑片 (图 2b, 2b)。连续脑切片 lc 中 dbh 信号的放大率如图 2d, 2d所示;为 th 染色的 lc 放大图像如图2f 所示.
- 使用与包含 lc 的部分相邻的部分进行进一步研究-在这种情况下, xfm 可以量化金属水平 (图 3)。
- 要执行 xfm, 收集 10-30μm (取决于设置) 薄日冕脑片在薄聚合物膜上, 它们可以安装在样品支架上, 并在同步加速器上成像。
- 在室温下储存在 xfm 的薄聚合物膜上制备的脑片, 并进行 xfm。
4. 通过 xfm 在 lc 中进行金属成像
- 如上面所述, 切片鼠标大脑示例, 确定 lc, 并通过 xfm 测量这些包含 lc 的大脑切片中的金属含量。
- 在高级光子源 (阿贡国家实验室, 阿贡伊利诺伊州) 的波束线2-id-e 上的图像元素分布。
- 如前面的 31所述, "动态" 记录数据。
- 使用 maps 32, 33 程序确定包含 lc的大脑切片中的元素浓度。
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Representative Results
金属稳态的变化 (如铜、铁、锌和锰) 经常在神经紊乱中观察到, 包括 lc34、35的变化。因此, 确定大脑中的金属含量对于了解疾病机制是必要的。使用所述协议生成的大脑部分可用于量化 lc 中的铜和其他金属的水平, 并将其与 lc 以外区域的水平进行比较。(图 3)。在我们的例子中, 测量了通过 lc、磷酸盐、钾、氯化物和铜切割的大脑切片。只有铜在 lc 中被专门提升。更高分辨率的 xfm 成像 (此处未显示) 也可以用于检测金属水平的亚细胞分布。该协议的其他可能应用包括检测 dbh (图 2b、2b、2b)、th (图 2b、2b) 以及单独或在 lc 中表达的其他蛋白质的丰度和细胞内分布。共染色检测, lc 形态学和神经元密度的研究。
图 1: lc 在鼠标脑干中的本地化.(a) 示意图, 说明将对脑干进行分割以使信用证本地化的区域。(b) 根据 paxinos 和富兰克林大脑图集 30, 当小脑和下大肠杆菌相互相遇时, lc 将最为突出 (-5.52 毫米后部的 bregma)。左图显示通过 lc 切割的冠状部分, 而右图像显示 lc 通过 nsl 染色在第4脑室侧缘的定位。(c) 一旦小脑完全分离, 不再包围下大肠杆菌 (-5.34 毫米后部的胸膜), lc 的最前部将消失。右图上的 nsl 染色显示, lc 仅在这个冠状切片中存在少量。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 通过 dbh 或 th 的免疫染色脑切片检测 lc.(a) 一只老鼠的大脑在脑干周围被切割成50微克的切片, 并收集在两个24口井盘中。每收集 5 到 8收集的大脑切片被安装在胶片覆盖物上, 通过 xfm 进行成像。这些切片在井间标记为蓝色数字。对漂浮在 pbs 中的相邻切片进行了 dbh 免疫染色, 以检测 lc (在井上贴上红色十字架)。绿色圆圈表示 dbh 信号的切片为正, 因此包含 lc。(b) 用 dbh 对含有 lc 的冠状脑片进行免疫染色, 并在共聚焦显微镜下进行成像。图像在 lc 中显示强信号 (绿色)。(c) 对含有 lc 的冠状切片进行了酪氨酸羟化酶 (th) 免疫染色, 并在荧光显微镜下进行了成像。图像显示左、右 lc 的强信号。(d) 对 dbh 的切片进行了免疫保留, 第7片 (左侧) 和第9片 (右侧) 含有 lc。选择相邻部分进行 xfm 分析。(e) 第10片也显示了 lc。在这一节中, 左 lc 被切割通过它的中心, 而右边的 lc 被捕获在它的最前部边缘。(f) 对含有 lc 的切片进行了 th 免疫染色, 并在共聚焦显微镜下进行了成像。图像显示 th 表达神经元在 lc 标记为绿色。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 在 lc 中成像金属水平.一个12周大的雄性老鼠的大脑与一个敲除 cu-运输器 atp7b 被分离和准备在这个协议中描述。采取了与含 lc 切片相邻的无染色切片, 并通过 xfm 测量金属含量。与周围的大脑区域相比, lc (标记为黄色箭头) 中的铜水平特别增加, 而其他元素 (k、p 和 cl) 则没有变化。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
正确定位样品是本协议中的关键一步。因为我们使用大脑背侧表面的解剖特征来定位 lc (小脑和下大肠杆菌之间的边界), 因此正确对齐各个部分是很重要的。这就需要小心, 把大脑适当地设置在老鼠的大脑切片器矩阵中。我们建议切割 ~ 500μm 以上的组织前和后 lc, 以避免丢失细胞核。最常见的错误是削减太少的部分, 导致完全错过 lc。因此, 对于第一次遵循此协议, 我们建议切割超过必要的部分。仔细研究染色前的大脑地图集图像是非常有帮助的。脑干的外观每几百微米就会发生明显的变化, 有了一些经验, 仅仅通过宏观的外观就可以知道哪些部分值得染色。
在 lc 本地化的过程中, 信号可能会发生变化, 这取决于大脑在切片过程中的方向程度。当切割通过 lc 的中心时, 信号是明亮的, 并且覆盖了一个更大的区域相比, lc 的边缘, 这将显示为一个信号在一个更小的区域。在日冕切片稍有倾斜的情况下, 第4脑室一侧的 lc 可能是明显的, 另一侧的 lc 可能只在相邻的幻灯片中可见。因此, 人们不能总是期望两个 lc 区域在一个大脑切片中的最大强度出现。这种伪影可以通过在小鼠大脑切片器基质中完全克隆出冠状, 并小心地将大脑嵌入 oct 的立体嵌入模型来避免。
免疫染色, 至少抗酪氨酸羟化酶抗体, 是非常宽容的, 根据我们的经验, 工作在厚度达100μm 的部分。我们发现, 对于 lc 的高信噪染色, 不需要阻塞解决方案, 从而降低成本并减少定位 lc 所需的时间。根据我们的经验, 染色协议可以通过将渗透率降低到2小时、初级抗体8小时和二级抗体2小时来加快--尽管染色质量和渗透率降低. 此外, 如果一个人只是对定位 lc 感兴趣的 (例如, 为了验证注射病毒追踪器), 固定大脑中的部分可以在100微米厚的振动体上被切割。
这个协议的一个局限性是, 从设计上看, 它需要对动物进行安乐死, 切除大脑。因此, 它不适用于体内定位 (例如, 电生理记录)。另一个限制是, 该协议要求 pfa 固定, 这可能会改变组织的原生状态。这些变化包括元素含量, 如铜, 钙, 铁和锌36。pfa 固定引起的金属分布的实际变化可以在一个样本中进行测试, 该样本可以与非固定样品平行运行。通过对这两个样品之间的金属分布的比较, 可以为 pfa 固定对一定研究感兴趣的金属分布的影响提供证据。如果必须避免 pfa 固定, 则该方案的一般原理 (通过免疫染色定位 lc, 并在后续实验中使用相邻切片) 可以在不固定的情况下扩展到冷冻切片。
我们注意到, 该协议在很大程度上是对解决这一问题的现有方法的改进。新颖性在于裁剪以前的方法来定位一个非常小的、容易漏掉的原子核。我们希望该协议可以很容易地修改和扩展的基础上, 根据需要 (例如, 使用转基因动物表达荧光在 lc, 以避免免疫染色)。
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Disclosures
没有。
Acknowledgments
我们感谢 abigael muchdididsi 维持了老鼠的殖民地。argonne 国家实验室先进光子源的使用得到了美国能源部、科学办公室、基础能源科学办公室的支持, 合同号为: de-ac02-06ch11357。我们感谢 olga antipova 和 stefan vogt 博士在高级光子源的用户支持和帮助。这项工作由国家卫生研究所向 sl 提供的赠款2r01gm101502 资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult mouse brain slicer matrix | Zivic Instruments | BSMAS001-1 | |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source - donkey) | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| Charged glass slides | Genesee | 29-107 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 505E | |
| Cryostat cutting blades | Thermo Fisher Scientific | MX35 | |
| Scissors Mini, 9.5cm | Antech Diagnostcs | 503241 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - inhouse production (source - rabbit) | B. Eipper | - | |
| Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - commercially availabe (source - rabbit) | Cell Signaling | 8586 | |
| Falcon tubes, 50ml | USA Scientific | 339652 | |
| Forane (isofluorane) | Baxter | NDC 1019-360-60 | |
| Forceps Micro Adson | Antech Diagnostcs | 501245 | |
| Hardset mounting media | EM sciences | 17984-24 | |
| Microscope | Pascal | LSM 5 | |
| Multi-well plates, 24 wells | Thermo Fisher Scientific | 930186 | |
| Optimal cutting temperature compound (OCT) | VWR/ tissue tech | 102094-106 | |
| Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10% | Fisher Scientific | SF98-4 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds | Polysciences Inc. | 18646A | |
| Pencil brush | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Tech | 14190250 | |
| Razor blades | Amazon | ASIN: B000CMFJZ2 | |
| Spatulas | Antech Diagnostcs | 14374 | |
| T pins | Office Depot | 344615 | |
| The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd Edition | Amazon | ISBN: 978-0123694607 | |
| Triton-X 100 (to prepare PBSD) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source - rabbit) | EMD Millipore | AB152 | |
| Ultralene thin film for XRF | SPEX Sample Prep | 3525 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 |
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神经科学 第145期 大脑 位点 大脑 金属 免疫组织化学 x 射线荧光显微镜 去甲肾上腺素 铜 dbh th atp7a ATP7AErratum
Formal Correction: Erratum: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 04/08/2019.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain. An author affiliation was updated.
The affiliation for Evan Maxey was updated from:
Department of Neuroscience, Johns Hopkins University
to:
X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory
