CRISPR ベース Cas9 の競争の試金を使用して遺伝的依存関係の調査
Summary
本稿では急性骨髄性白血病 (AML) 細胞増殖で複数の候補者の遺伝子の役割を簡単かつ迅速な捜査のためクラスター化定期的に空間短い回文を繰り返す (CRISPR) CRISPR ベース Cas9 方法を記述します。並列。この手法はスケーラブル、他癌細胞を同様に適用することができます。
Abstract
遺伝子摂動の研究は、急性骨髄性白血病の病因における個別遺伝子の役割を調べるため広く使用されています。これらの研究の多くをした完全な遺伝子破壊を達成するための複雑な遺伝子ノックアウト モデルを使用します。ノックアウト マウスとこれらの研究は、遺伝子型-表現型の関係を調査するためのエレガントで実績のあるシステムを提供しながら候補者の遺伝子を評価するための迅速かつスケーラブルな方法再生急性骨髄性白血病細胞増殖における役割またはアジア ・ マイル リミテッド モデルで生存複数の候補者の遺伝子の並列の尋問を加速するのに役立ちます。ゲノム編集技術の最近の進歩は、前例のない規模で遺伝的摂動を実行する当社の能力を大幅に強化しました。ゲノム編集の 1 つのようなシステムは、ターゲット細胞のゲノムに迅速かつ効果的な変更を加えるに使用することができます CRISPR ベース Cas9 の方法です。使いやすさとスケーラビリティ CRISPR/Cas9 を介した遺伝子削除のそれに 1 つ遺伝子の多数の尋問のための最も魅力的な技術表現型の試金。ここ、CRISPR/Cas9 を介した遺伝子破壊高スループット流れ cytometry による競争の試金と組み合わせてを使用して増殖に重要な役割を果たす可能性があります遺伝子の役割や人間の生存率を調査する簡易測定法を提案し、マウスの急性骨髄性白血病細胞株。
Introduction
過去数十年間は、急性骨髄性白血病 (AML) の病因に重要な分子経路の貢献を識別するのに焦点を当てた多くの研究努力を見てきました。伝統的に、急性骨髄性白血病細胞における遺伝子破壊は条件付きノックアウト マウスまたは短いヘアピン RNA (shRNA) を使用して行われています。ノックアウト マウスは、遺伝子欠失の時空間的制御のための洗練されたシステムを提供する間は、手間、時間がかかり、高価なは遺伝子ノックアウト マウスを生成します。さらに、遺伝子のノックアウト再結合戦略を使用して拡張が容易ではないです。これらの戦略は並列で複数の遺伝子の尋問によく自分自身を貸すか。小さい干渉の RNA (siRNA) または shRNA を使用してノック ダウン内因性 Mrna に RNA 干渉法の発見は後の多くのグループ AML の特定の遺伝子の役割を調査する RNA 干渉技術を使用し始めた。マウスとヒトの急性骨髄性白血病細胞は脂質ベースのトランスフェクションを伝統的な方法を使用して transfect に困難なのでほとんど lentivirally 採用、レトロ ウイルスでエンコードされた shRNA 急性骨髄性白血病細胞における遺伝子の機能を研究するための研究します。最近の発見は、定期的に空間の短い回文繰り返し (CRISPR) をクラスター化し、関連付けられた Ca 核酸 (CRISPR Cas9) は遺伝子ターゲティング技術1,2,3に革命をもたらしました。CRISPR Cas9 を使用して、特定の遺伝子やゲノム領域削除、編集またはできますが付いた検索効率と使いやすさ。CRISPR ベース Cas9 遺伝子編集は、シンプルさ、有効性、この技術の幅広い適用性などの多様な細胞型の遺伝子型-表現型の関係を調査するための選択の方法として現れている今。CRISPR ベース Cas9 の方法も急性骨髄性白血病、個々 の遺伝子の尋問だけを目的としたアレイまたはプールされた遺伝的画面に複数の遺伝子を対象とする方法としても可能性として並列にいくつかの遺伝子の調査での選択の方法になっています。アジア ・ マイル リミテッド依存関係4,5,6。
本稿では、安定した CRISPR Cas9 仲介された遺伝子 – に続く編集高スループット フローサイトメトリーに基づく急性骨髄性白血病細胞の成長の遺伝子破壊の影響を測定するための単純な競争力のある成長アッセイをについて説明します。このメソッドは、シンプルで効率的、かつ急性骨髄性白血病細胞における並列にいくつかの遺伝子の役割を調査するため媒体スループット実験にスケーラブルです。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、人間/マウス急性骨髄性白血病細胞 (図 5) でフローサイトメトリーを用いた急性骨髄性白血病細胞株における候補者の遺伝子の役割を調査する競争力のある成長の CRISPR ベース Cas9 アッセイを行うための詳しいプロトコルについて述べる。分析の目的は、中規模で 2、3 週間以上の急性骨髄性白血病細胞の増殖維持に関する遺伝子欠失の影響を識別するためにで…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCW Cas9 プラスミドだったエリック ・ ランダー & デヴィッド ・ サバティーニ (Addgene プラスミド # 50661) と pKLV2 U6gRNA5 (BbsI) – PGKpuro2ABFP – からの贈り物 W プラスミドから遊佐ラボ (Addgene プラスミド #67974。フローの分析と並べ替えとタイムリーなヘルプ SBP 医療探索所フローサイトメトリー コアに感謝したいと思います。西暦女性タタ記念財団のサポートを確認したいと思いますまた次の資金調達のサポートを確認したいと思います: NIH/NCI P30 CA030199 がんセンター主催グラント、V 財団とサンディエゴの NCI のがんセンター (C3) #PTC2017to A.J.D.
Materials
| FLAG-M2 Antibody | sigma-aldrich | F3165, lot # SLBS3530V | |
| Anti-mouse Antibody | Invitrogen | 31446, lot # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc Imaging System | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Red | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SAFC | 12303C | |
| single gRNA vector | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic Nuclear extraction kit | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| T4 PNK | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA ligation buffer | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA Ligase enzyme | NEBioLabs | M0202S | |
| Ampicillin | Fisher scientific | BP1760-25 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB Broth | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| Recombinant Murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant Murine M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| Stable competent cells | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm Tissue Culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Cell lysis solution | Qiagen | 158906 | |
| Protein precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| DNA hydration solution | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit | Genessee Scientific | 42-138 | |
| Puromycin | Fisher scientific | BP2956100 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495970C |
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