Исследование генетических зависимостей с помощью анализов на основе ТРИФОСФАТЫ Cas9 конкурс
Summary
Эта рукопись описывает основанный ТРИФОСФАТЫ-Cas9 метод кластерного регулярно Interspaced короткие палиндром повторяет (ТРИФОСФАТЫ) для простого и оперативного расследования роли нескольких генов кандидат в острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) пролиферации в параллельно. Эта техника является масштабируемым и может быть применен в других рак клеточных линий, а также.
Abstract
Джин возмущений исследования широко используются для изучения роли отдельных генов в патогенезе бод. Для достижения полной гена срыв, многие из этих исследований сделали использовать сложные гена нокаут моделей. Хотя эти исследования с нокаут мышей предлагают элегантный и проверенные временем системы для расследования взаимоотношений генотип фенотип, быстрый и масштабируемый метод для оценки кандидата генов, которые играют роль в AML пролиферации или выживания в моделях ПФТ поможет ускорить параллельных допроса нескольких генов кандидата. Последние достижения в технологии изменения генома резко повысили нашу способность выполнить генетических возмущений в беспрецедентных масштабах. Одна такая система генома редактирования является основанный ТРИФОСФАТЫ-Cas9 метод, который может использоваться для сделать быстрые и эффективные изменения в геноме целевой ячейки. Простоту и масштабируемость ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной ген-удаления делает его одним из самых привлекательных методов допроса большого числа генов в фенотипических анализов. Здесь мы представляем простой анализа с использованием ТРИФОСФАТЫ/Cas9 при посредничестве ген нарушения в сочетании с высокой пропускной способностью на основе потока цитометрии конкуренции анализов расследовать роль генов, которые могут играть важную роль в распространении или выживания человека и мышиных ПФТ клеточных линий.
Introduction
В последние несколько десятилетий стали свидетелями многочисленных исследований было сосредоточено на выявлении вклад основные молекулярные пути в патогенезе острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). Традиционно ген нарушения в клетках AML была выполнена с использованием условной нокаут мышей или шпильки короткие РНК (индуцируемый). В то время как нокаут мышей предлагают сложную систему для пространственно временной контроль ген-удаления, генерации мышей Нокаут гена трудоемкий, длительным и дорогостоящим. Кроме того ген просвечивание с помощью рекомбинации стратегии не легко масштабируемой; Эти стратегии не хорошо подходят для допроса нескольких генов параллельно. После открытия РНК интерференции методы для нокдауна эндогенного мРНК, используя малые интерферирующие РНК (siRNA) или индуцируемый многие группы началась с использованием методов РНК интерференции для расследования роли конкретных генов в борьбе с отмыванием денег. Поскольку мышиных и человеческие клетки AML сложно transfect методами традиционной липидных трансфекции, большинство исследований работает lentivirally или retrovirally кодировке индуцируемый для изучения функции генов в клетках бод. Недавнее открытие кластеризованной регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ) и связанные Cas nucleases (ТРИФОСФАТЫ-Cas9) революционизировало ген ориентация технологии1,2,3. С помощью ТРИФОСФАТЫ-Cas9, конкретные гены или геномных регионов может быть удален, редактировать или с меткой эффективность и простота. ТРИФОСФАТЫ-Cas9-редактирование на основе гена теперь становится методом выбора для расследования взаимоотношений генотип фенотип в типах различных клеток, благодаря простоте, эффективности и широкого применения этой техники. Методы, основанные на ТРИФОСФАТЫ-Cas9 также становится методом выбора в борьбе с отмыванием денег, не только для допроса отдельных генов, но также, как способ для нескольких генов в выстроились или пула генетической экраны, направленных на расследование нескольких генов параллельно как потенциал AML-зависимости4,5,6.
В этой рукописи мы опишем простой конкурентных роста assay для измерения воздействия ген беспорядки на рост клеток ПФТ, основанный на стабильной ТРИФОСФАТЫ-Cas9-опосредованной ген редактирования следуют высок объём проточной цитометрии. Этот метод является простой, эффективной и масштабируемой пропускной способности среднего экспериментов для изучения роли нескольких генов параллельно в клетках бод.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой рукописи мы описываем подробный протокол для проведения пробирного ТРИФОСФАТЫ-Cas9 основе конкурентоспособных роста расследовать роль генов кандидата в AML клеточных линий с помощью проточной цитометрии в клетках человека/мышиных AML (рис. 5). Цель анализа требуется …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Плазмиды pCW-Cas9 был подарок от Eric Lander и Дэвид Сабатини (плазмида # 50661 Addgene) и pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) – PGKpuro2ABFP – W плазмиды от Юса лаборатории (плазмида #67974 Addgene. Мы хотели бы поблагодарить проточной цитометрии ядро SBP медицинского открытия Института за своевременную помощь с анализа потока и сортировки. Мы хотели бы отметить поддержку леди Тата Мемориальный фонд до н.э. Мы хотели бы также отметить поддержку следующие источники финансирования: NIH/NCI Р30 CA030199 рака центр при поддержке гранта, Сан-Диего NCI рака центров (C3) и V-фонд #PTC2017to A.J.D.
Materials
| FLAG-M2 Antibody | sigma-aldrich | F3165, lot # SLBS3530V | |
| Anti-mouse Antibody | Invitrogen | 31446, lot # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc Imaging System | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Red | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SAFC | 12303C | |
| single gRNA vector | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic Nuclear extraction kit | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| T4 PNK | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA ligation buffer | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA Ligase enzyme | NEBioLabs | M0202S | |
| Ampicillin | Fisher scientific | BP1760-25 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB Broth | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| Recombinant Murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant Murine M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| Stable competent cells | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm Tissue Culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Cell lysis solution | Qiagen | 158906 | |
| Protein precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| DNA hydration solution | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit | Genessee Scientific | 42-138 | |
| Puromycin | Fisher scientific | BP2956100 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495970C |
References
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Shi, J., et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).
- Kuhn, M. W., et al. Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia. Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).
- Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).
- Nguyen, A. T., Zhang, Y. The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation. Genes & Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).
- Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).
- Bernt, K. M., et al. MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L. Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).
- Daigle, S. R., et al. Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor. Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).
- Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation. Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).
- Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis. Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).
- Zuber, J., et al. Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi. Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Li, M. J., Rossi, J. J. Lentivirus transduction of hematopoietic cells. CSH Protocols. 2007, (2007).
