CRISPR-Cas9-기반 경쟁 분석 실험을 사용 하 여 유전 종속성의 조사
Summary
이 원고에서 급성 골수성 백혈병 (AML) 세포 증식에 여러 후보 유전자의 역할의 간단 하 고 신속 하 게 조사에 대 한 클러스터 정기적으로 Interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) CRISPR-Cas9-기반 방법을 설명 합니다. 병렬입니다. 이 기술은 확장성 이며 다른 암 세포 라인에 적용 될 수 있습니다.
Abstract
진 섭 동 연구 AML pathogenesis 개별 유전자의 역할을 조사 하기 위해 광범위 하 게 사용 되었습니다. 이러한 연구의 대부분을 만들었습니다 달성을 위한 완전 한 유전자 장애, 복잡 한 유전자 녹아웃 모델의 사용. 녹아웃 쥐와 이러한 연구는 유전자 형 관계를 조사 하는 우아하고 시간 시스템 제공, 후보 유전자를 평가 하기 위한 신속 하 고 확장 가능한 방법 하는 AML 세포 증식에 역할 또는 재생 AML 모델에 생존 여러 후보 유전자의 병렬 심문을 촉진 하는 것을 도울 것 이다. 게놈 편집 기술에서 최근의 진보는 극적으로 전례 없는 규모에 유전 섭 수행 하는 우리의 능력 향상 된. 편집 하는 게놈의 한 그러한 시스템 대상 셀 게놈에 신속 하 고 효과 변경을 하는 데 사용할 수 있는 CRISPR-Cas9-기반 방법입니다. 편리 하 고 CRISPR/Cas9-중재 유전자 삭제의 확장성은 유전자의 많은 수의 심문에 대 한 가장 매력적인 기술 중 하나 phenotypic 분석 실험에 있습니다. 여기, 우리 인간의 생존 또는 확산에 중요 한 역할을 재생할 수 있는 유전자의 역할을 조사 하기 위해 중재 CRISPR/Cas9 유전자-중단 높은 처리량 흐름 cytometry-기반 경쟁 분석 실험 결합을 사용 하 여 간단한 분석 결과 제시 하 고 murine AML 셀 라인입니다.
Introduction
지난 몇 년간 주요 분자 경로 급성 골수성 백혈병 (AML) 병 인에의 기여를 식별에 초점을 맞춘 많은 연구 노력을 보았다. 전통적으로, 급성 골수성 백혈병 세포에 유전자 중단 조건부 녹아웃 쥐 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 사용 하 여 수행 되었습니다. 녹아웃 쥐의 유전자 삭제 spatio 시간적 제어를 위한 정교한 시스템을 제공, 유전자 녹아웃 쥐 생성 이며 노동 집약, 시간이 걸리는 비싼. 또한, 유전자 녹아웃 재결합 전략을 사용 하는 쉽게 확장할 수 없습니다; 이러한 전략 병렬로 여러 유전자의 심문에 잘 자신을 빌려 하지 않습니다. 노크 다운 생 mRNAs 작은 간섭 RNA (siRNA) 또는 shRNA 사용 하 게 RNA 방해 방법의 발견 후 많은 그룹 AML에 있는 특정 유전자의 역할을 조사 하기 위해 RNA 간섭 기법을 사용 하 여 시작 했다. 모두 인간과 murine AML 셀 악명 어려운 전통적인 지질에 기초를 둔 transfection 방법 transfect 이기 때문에, 대부분 급성 골수성 백혈병 세포에 유전자 기능 연구에 대 한 고용 lentivirally 또는 retrovirally로 인코딩된 shRNA 공부 한다. 최근 검색 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) 그리고 관련된 Ca nucleases (CRISPR-Cas9) 유전자를 대상으로 기술1,2,3에 혁명을 했다. CRISPR-Cas9를 사용 하 여, 특정 유전자 또는 genomic 지구 수 수 삭제, 편집 또는 태그와 효율성 및 용이성. CRISPR-Cas9-기반 유전자 편집은 이제 단순, 효과, 및이 기술의 광범위 한 적용 다양 한 셀 형식에 유전자 형 관계를 조사 하기 위한 선택의 방법으로 나오고 있다. CRISPR-Cas9-기반 방법은 방법의 AML, 뿐만 아니라 개별 유전자를 심문 하지만 또한 기준점과 또는 풀링된 유전 스크린에 여러 유전자를 대상 하는 방법을 위한 잠재력으로 동시에 여러 유전자 조사에 선택 되 고 또한 있다 AML 종속성4,,56.
이 원고에서 우리는 유전자-중단 안정적인 CRISPR Cas9 중재 하는 유전자-편집 높은 처리량 cytometry 뒤에 따라 급성 골수성 백혈병 세포의 성장에 미치는 영향을 측정 하기 위한 간단한 경쟁 성장 분석 결과 설명 합니다. 이 방법은 간단 하 고 효율적인, 중간 처리 실험 조사 AML 셀에 동시에 여러 유전자의 역할에 대 한 확장입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고에서 우리는 AML 셀 라인-cytometry 인간/murine 급성 골수성 백혈병 세포 (그림 5)에서 사용 하 여 후보 유전자의 역할을 조사 하는 CRISPR-Cas9-기반 경쟁 성장 분석 결과 실시 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 분석 결과의 목표는 급성 골수성 백혈병 세포 증식의 유지 보수에 유전자 삭제의 효과 매체 처리량 규모에 2 ~ 3 주 이상입니다. 몇 가지 중요 한 단계 설명된 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCW Cas9 플라스 미드 에릭 랜더 & 데이비드 사바 티 니 (Addgene 플라스 미드 # 50661)와 pKLV2-U6gRNA5 (BbsI)-PGKpuro2ABFP-에서 선물 했다 な 연구소 (Addgene 플라스 미드 # 67974에서에서 플라스 미드 W. 우리에 대 한 적시 흐름 분석 및 정렬 SBP 의료 디스커버리 연구소에서 Cytometry 코어를 감사 하 고 싶습니다. 우리 인정 서에 레이디 타 타 기념 재단의 지원 하 고 싶습니다. 우리는 다음 자금 출처의 지원 인정 하 고 싶습니다: NIH/NCI P30 CA030199 암 센터 후원 그랜트, V-기초와 샌디에고 NCI 암 센터 (C3) #PTC2017to A.J.D.
Materials
| FLAG-M2 Antibody | sigma-aldrich | F3165, lot # SLBS3530V | |
| Anti-mouse Antibody | Invitrogen | 31446, lot # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc Imaging System | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Red | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SAFC | 12303C | |
| single gRNA vector | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic Nuclear extraction kit | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| T4 PNK | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA ligation buffer | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA Ligase enzyme | NEBioLabs | M0202S | |
| Ampicillin | Fisher scientific | BP1760-25 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB Broth | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| Recombinant Murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant Murine M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| Stable competent cells | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm Tissue Culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Cell lysis solution | Qiagen | 158906 | |
| Protein precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| DNA hydration solution | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit | Genessee Scientific | 42-138 | |
| Puromycin | Fisher scientific | BP2956100 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495970C |
References
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