आनुवंशिक निर्भरता की जांच CRISPR-Cas9-आधारित प्रतियोगिता परख का उपयोग
Summary
इस पांडुलिपि का वर्णन एक संकुल नियमित रूप से अंतराल लघु Palindromic दोहराता (CRISPR) CRISPR-Cas9-आधारित विधि तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) सेल प्रसार में कई उंमीदवार जीन की भूमिका की सरल और शीघ्र जांच के लिए समानांतर. इस तकनीक स्केलेबल है और अंय कैंसर सेल लाइनों में लागू किया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह से ।
Abstract
जीन गड़बड़ी अध्ययनों को एएमएल रोगजनन में व्यक्तिगत जीन की भूमिका की जांच के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है. पूरा जीन व्यवधान प्राप्त करने के लिए, इन अध्ययनों के कई जटिल जीन नॉकआउट मॉडल का उपयोग किया है । हालांकि नॉकआउट चूहों के साथ ये अध्ययन जीनोटाइप-टू-phenotype संबंधों की जांच के लिए एक सुरुचिपूर्ण और समय-परीक्षण प्रणाली की पेशकश करते हैं, जो उंमीदवार जीन का आकलन करने के लिए एक तीव्र और स्केलेबल विधि है, जो एएमएल मॉडल में एएमएल सेल प्रसार या अस्तित्व में भूमिका निभाते हैं एकाधिक उंमीदवार जीन के समानांतर पूछताछ में तेजी लाने में मदद मिलेगी । जीनोम में हाल ही में अग्रिम-संपादन प्रौद्योगिकियों नाटकीय रूप से हमारे एक अभूतपूर्व पैमाने पर आनुवंशिक perturbations प्रदर्शन करने की क्षमता को बढ़ाया है । एक जीनोम संपादन की ऐसी प्रणाली CRISPR-Cas9 आधारित विधि है कि लक्ष्य सेल जीनोम में तेजी से और प्रभावोत्पादक परिवर्तन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । CRISPR/Cas9 की सहजता और दरिद्रता-मध्यस्थता जीन-विलोपन यह phenotypic परख में जीन की एक बड़ी संख्या के पूछताछ के लिए सबसे आकर्षक तकनीकों में से एक बनाता है । यहां, हम एक सरल CRISPR/Cas9 मध्यस्थता जीन-व्यवधान उच्च प्रवाह प्रवाह के साथ संयुक्त-cytometry-आधारित प्रतियोगिता परख के लिए जीन की भूमिका की जांच है कि प्रसार या मानव के अस्तित्व में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है और murine एएमएल कक्ष रेखाएं ।
Introduction
पिछले कुछ दशकों में कई अनुसंधान तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) रोगजनन में प्रमुख आणविक रास्ते के योगदान की पहचान पर ध्यान केंद्रित प्रयासों को देखा है । परंपरागत रूप से, एएमएल कोशिकाओं में जीन व्यवधान सशर्त नॉकआउट चूहों या लघु hairpin आरएनए (shRNA) का उपयोग किया गया है । जबकि नॉकआउट चूहों जीन-विलोपन के spatio-लौकिक नियंत्रण के लिए एक परिष्कृत प्रणाली की पेशकश, जीन नॉकआउट चूहों पैदा श्रम गहन, समय लेने वाली और महंगी है । इसके अलावा, जीन-नॉकआउट पुनर्संयोजन रणनीतियों का उपयोग आसानी से स्केलेबल नहीं है; इन रणनीतियों खुद को अच्छी तरह से समानांतर में कई जीन की पूछताछ के लिए उधार नहीं है । छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरना) या shRNA का उपयोग mRNAs अंतर्जात नीचे दस्तक करने के लिए आरएनए हस्तक्षेप विधियों की खोज के बाद, कई समूहों एएमएल में विशिष्ट जीन की भूमिका की जांच करने के लिए आरएनए हस्तक्षेप तकनीक का उपयोग शुरू कर दिया. दोनों murine और मानव एएमएल कोशिकाओं के बाद से पारंपरिक लिपिड आधारित अभिकर्मक तरीकों का उपयोग कर transfect के लिए बेहद मुश्किल है, सबसे अध्ययन lentivirally कोशिकाओं में जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए retrovirally या shRNA इनकोडिंग एएमएल कार्यरत हैं । संकुल की हाल ही की खोज नियमित रूप से अंतराल लघु palindromic दोहराता (CRISPR) और संबद्ध कैस nucleases (CRISPR-Cas9) जीन लक्ष्यीकरण प्रौद्योगिकियों1,2,3में क्रांति ला दिया है । CRISPR-Cas9, विशिष्ट जीन या जीनोमिक क्षेत्रों का उपयोग कर हटाया, संपादित किया जा सकता है या दक्षता और आसानी के साथ टैग । CRISPR-Cas9 आधारित जीन-संपादन अब सादगी, प्रभावशीलता, और इस तकनीक की व्यापक प्रयोज्यता के कारण विविध कोशिका प्रकार में जीनोटाइप-phenotype संबंधों की जांच के लिए पसंद की विधि के रूप में उभर रहा है । CRISPR-Cas9 आधारित तरीकों को भी एएमएल में पसंद की विधि बन रहे हैं, न केवल व्यक्तिगत जीन पूछताछ के लिए, लेकिन यह भी एक तरीका है सरणी या परित आनुवंशिक में कई जीन लक्ष्य के रूप में समानांतर में अनेक जीन की जांच के उद्देश्य से स्क्रीन क्षमता एएमएल-निर्भरताएं4,5,6।
इस पांडुलिपि में, हम एएमएल कोशिकाओं के विकास पर जीन-व्यवधान के प्रभाव को मापने के लिए एक सरल प्रतिस्पर्धी विकास परख का वर्णन करते हैं, जो स्थिर CRISPR-Cas9-मध्यस्थता जीन-संपादन के बाद उच्च-प्रवाह प्रवाह cytometry के आधार पर किया जाता है । इस विधि एएमएल कोशिकाओं में समानांतर में कई जीनों की भूमिका की जांच के लिए मध्यम प्रवाह प्रयोगों के लिए सरल, कुशल, और स्केलेबल है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पांडुलिपि में, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एक CRISPR-Cas9 आधारित प्रतिस्पर्धी विकास परख के लिए एएमएल सेल लाइनों में उंमीदवार जीन की भूमिका की जांच प्रवाह का उपयोग कर मानव में cytometry/murine एएमएल क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pCW-Cas9 प्लाज्मिड ने एरिक लैंडर & डेविड Sabatini (Addgene प्लाज्मिड # ५०६६१) से उपहार और pKLV2-U6gRNA5 (BbsI)-PGKpuro2ABFP-डब्ल्यू प्लाज्मिड लैब (युस Addgene #67974 से प्लाज्मिड । हम प्रवाह विश्लेषण और छंटाई के साथ समय पर मदद के लिए एसबीपी चिकित्सा डिस्कवरी संस्थान में प्रवाह Cytometry कोर धंयवाद देना चाहूंगा । हम लेडी टाटा मेमोरियल फाउंडेशन के सहयोग को स्वीकार करना चाहते है ईसवी हम भी निंनलिखित धन स्रोतों के समर्थन को स्वीकार करना चाहूंगा: NIH/NCI P30 CA030199 कैंसर केंद्र प्रायोजित अनुदान, वी फाउंडेशन और सैन डिएगो NCI कैंसर केंद्रों (C3) #PTC2017to A.J.D.
Materials
| FLAG-M2 Antibody | sigma-aldrich | F3165, lot # SLBS3530V | |
| Anti-mouse Antibody | Invitrogen | 31446, lot # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc Imaging System | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Red | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SAFC | 12303C | |
| single gRNA vector | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic Nuclear extraction kit | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| T4 PNK | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA ligation buffer | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA Ligase enzyme | NEBioLabs | M0202S | |
| Ampicillin | Fisher scientific | BP1760-25 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB Broth | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| Recombinant Murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant Murine M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| Stable competent cells | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm Tissue Culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Cell lysis solution | Qiagen | 158906 | |
| Protein precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| DNA hydration solution | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit | Genessee Scientific | 42-138 | |
| Puromycin | Fisher scientific | BP2956100 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495970C |
References
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