Ved hjælp af forbedret grønne fluorescens Protein-udtryk for Escherichia Coli at vurdere musen Peritoneal makrofag fagocytose
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at vurdere musen peritoneal makrofag fagocytose ved hjælp af forbedrede grønne fluorescens protein-udtrykker Escherichia coli.
Abstract
Dette manuskript beskriver en simpel og reproducerbar metode for at udføre en fagocytose assay. Den første del af denne metode indebærer etablering af en pET-SUMO-EGFP vektor (SUMO = lille ubiquitin-lignende modifier) og give udtryk for forbedret grønne fluorescens protein (EGFP) i Escherichia coli (BL21DE). EGFP-udtrykker E. coli er coincubated med makrofager i 1 timer ved 37 ° C; negativ kontrolgruppen er udruget på is i den samme mængde tid. Makrofager er klar til vurdering. Fordelene ved denne teknik omfatter dens enkel og ligetil trin, og fagocytose kan måles ved begge flow forskellige og fluorescens mikroskop. EGFP-udtrykker E. coli er stabil og vise en stærk fluorescens signal, selv efter makrofager er rettet med PARAFORMALDEHYD. Denne metode er ikke kun egnet til vurdering af makrofag cellelinjer eller primære makrofager in vitro- men også egnet til evaluering af granulocyt og monocyt fagocytose i perifert blod mononukleære celler. Resultaterne viser, at peritoneal makrofager fra unge (otte uger gamle) mus fagocyterende kapacitet er større end makrofager fra alderen (16-måned-forhenværende) mus. I Resumé, denne metode måler makrofag fagocytose og er velegnet til at studere funktionen medfødte immunsystem.
Introduction
Makrofag fagocytose assays bruges ofte til at studere det medfødte immunforsvar. Det medfødte immunforsvar kan indikere modtagelighed for infektion. Makrofag cellelinjer er meget udbredt i immunologi undersøgelser. Men den udvidede passage kan medføre tab af genet og kompromitteret immun funktioner i disse cellelinjer. De primære peritoneal makrofager er derfor det ideelle objekt i at studere celle funktion1.
Selv om den medfødte immunforsvar var menes at være intakt i alderen kroppen, kan fagocyterende evnen falde i forhold til, at i den yngre krop2,3. Her vil vi vise en metode til at vurdere fagocytose af peritoneal makrofager fra young (otte uger gamle) og alderen (16-måned-forhenværende) mus ved hjælp af EGFP-udtrykker E. coli, som er nem, hurtig og økonomisk gennemførlig.
Brug af en EGFP-udtrykker E. coli -stamme er en af fordelene ved denne analyse, fordi disse bakterier er stabil og vise en stærk fluorescens signal, selv efter makrofager fastsættes ved 4% (w/v) PARAFORMALDEHYD. Derudover ved hjælp af de EGFP udtryk for E. coli, forskerne behøver ikke yderligere farvning efter fagocytose, hvilket sparer tid. Makrofager er desuden immunoresponsive for E. coli overflade antigen, hvilket gør E. coli mere velegnet til fagocytose assay end ved hjælp af EGFP-udtrykker svampe eller fluorescein-mærket perler.
Med EGFP-udtrykker E. coli, kan en fagocytose assay nemt udført i 2 h og målt af begge flow flowcytometri og Fluorescens mikroskopi, afhængigt af forskerens formål. Da denne metode måler direkte fagocyterende evne, er resultaterne mere reproducerbare end andre indirekte metoder.
Denne metode er også blevet valideret i en RAW264.7 cellelinje og humant perifert blod mononukleære celler4. Nedenstående tekst giver detaljerede trinvise instruktioner til at udføre denne analyse og fremhæver de kritiske faser, som forskerne kan ændre for at opfylde behovene hos deres eksperimenter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trinene i denne protokol er ganske enkel og ligetil. Et af de vigtige skridt er at fremkalde EGFP udtryk på E. coli. Normalt, når et gen fra eukaryoter, som EGFP, er planlagt til at udtrykke i prokaryoter som E. coli, er der en risiko at proteinet vil danne inaktive aggregater (inklusion organer), som ændrer proteinets indfødte struktur og aktivitet. Ved hjælp af pET-SUMO vektor og konstruere pET-SUMO-EGFP plasmid, EGFP-SUMO fusion protein udtrykt med succes, og den lyssignal var stærk nok til at …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den National Natural Science Foundation of China (nr. 31800046) og Natural Science Foundation i Liaoning provinsen (no. 20170540262) støttet dette arbejde. Dette arbejde blev udført i laboratorierne i videnskabelig Research Center på det andet Hospital i Dalian medicinske universitet. Forfatterne vil gerne takke Xiao-Lin Sang for hendes hjælp med flowcytometri, og Bo Qu og Dong-Chuan Yang for deres hjælp i at producere video.
Materials
| BD FACSCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | – | |
| Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | Cat101303 | |
| Champion pET SUMO Protein Expression system | Invitrogen | K300-01 | |
| Custom Gene Synthesis Service | Takara Biotech. | – | |
| DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher | D1306 | |
| F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS | Biolegend | Cat123110 | |
| Leica DMI3000 B Inverted Microscope | Leica Microsystems | – | |
| PE Rat IgG2a, κ-isotype control | Biolegend | Cat400507 | |
| Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution | AAT Bioquest | Cat23125 | |
| Thioglycollate medium | Sigma-Aldrich | T9032 |
References
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. Journal of Visualized Experiments. 98, e52749 (2015).
- Iskander, K. N., et al. Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding. Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).
- Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management. Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).
- Bicker, H., et al. A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria. Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).
- Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. Universal TA cloning. Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).
- Chen, Q., et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Weingart, C. L., et al. Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils. Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).
- Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species. Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).
- Ninkovic, J., Roy, S. High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization. Journal of Visualized Experiments. (93), e52195 (2014).
