Använda förbättrade grön fluorescens Protein-uttryckande Escherichia Coli att bedöma mus Peritoneal makrofag fagocytos
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att bedöma mus peritoneal makrofag fagocytos med förbättrad grön fluorescens protein-uttryckande Escherichia coli.
Abstract
Detta manuskript beskriver en enkel och reproducerbar metod för att utföra en fagocytos assay. Den första delen av denna metod innebär att bygga en pET-SUMO-andra vektor (SUMO = små ubiquitin-liknande modifierare) och uttrycker förbättrad grön fluorescens protein (andra) i Escherichia coli (BL21DE). ANDRA-uttryckande E. coli är coincubated med makrofager för 1 h vid 37 ° C; den negativa kontrollgruppen inkuberas på is för samma belopp av tid. Makrofager är sedan redo för bedömning. Fördelarna med denna teknik är dess enkel och okomplicerad steg och fagocytos kan mätas genom både flöde cytometer och fluorescens Mikroskop. Den andra-uttryckande E. coli är stabila och visa en stark fluorescens signal även efter makrofager korrigeras med PARAFORMALDEHYD. Denna metod är inte bara lämplig för bedömningen av makrofag cellinjer eller primära makrofager i vitro men även lämplig för utvärdering av granulocyt och monocyt fagocytos i perifera mononukleära blodceller. Resultaten visar att fagocytos kapacitet av peritoneal makrofager från unga (åtta veckor gamla) möss är högre än för makrofager från åldern (16 månader gamla) möss. Sammanfattningsvis, metoden mäter makrofag fagocytos och är lämplig för att studera funktionen medfödda immunsystemet.
Introduction
Makrofag fagocytos analyser används ofta för att studera det medfödda immunförsvaret. Medfödda immunsvaret kan tyda infektionskänslighet. Makrofag cellinjer används allmänt i immunologi studier. Dock utökade passagen kan orsaka genen och äventyras immun funktioner i dessa cellinjer. Primär peritoneal makrofager är således perfekt objektet som att studera cell funktion1.
Även om medfödda immunsvaret ansågs vara intakt i år kroppen, kan fagocytos förmågan minska jämfört med att i den yngre kropp2,3. Här kommer vi att visa en metod för att bedöma fagocytos av peritoneal makrofager från ung (åtta veckor gamla) och äldre (16 månader gamla) musen använder andra-uttryckande E. coli, vilket är bekvämt, snabbt och ekonomiskt genomförbart.
Användning av en andra-uttryckande E. coli -stam är en av fördelarna med denna analys eftersom dessa bakterier är stabila och visa en stark fluorescens signal, även efter det att makrofager korrigeras av 4% (w/v) PARAFORMALDEHYD. Dessutom, genom att använda den andra-uttryckande E. coli, forskare behöver inte ytterligare färgning efter fagocytos, vilket sparar tid. Makrofager är dessutom immunoresponsive för E. coli ytantigen, att göra E. coli mer lämpade för fagocytos analysen än med andra-uttryckande svampar eller fluorescein-märkt pärlor.
Med andra-uttryckande E. coli, kan en fagocytos assay lätt fulländat i 2 h och mätt med både flöde flödescytometri och fluorescence mikroskopi, beroende på forskarens syfte. Eftersom denna metod mäter direkt fagocytos förmågan, är resultaten mer reproducerbar än andra indirekta metoder.
Denna metod har också verifierats i en RAW264.7 cell fodrar och människans perifera mononukleära celler4. Texten nedan finns detaljerade stegvisa instruktioner för att utföra denna analys och belyser de kritiska steg som forskarna kan modifiera för att möta behoven hos sina experiment.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stegen i detta protokoll är ganska enkel och okomplicerad. En av de kritiska steg är att framkalla andra uttryck på E. coli. Vanligtvis, när en gen från Eukaryoter, liksom andra, planeras att uttrycka i prokaryoter som E. coli, finns det en risk att proteinet kommer att bilda inaktiva aggregat (inkludering organ), som ändrar proteinets infödda struktur och verksamhet. Med hjälp av pET-SUMO vektorn och konstruera pET-SUMO-andra plasmiden, den andra-SUMO fusionsprotein uttryckt framgångsrikt, och…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (nr. 31800046) och naturvetenskap Foundation i Liaoning-provinsen (nr 20170540262) stött detta arbete. Detta arbete var fulländat i laboratorier av vetenskapliga forskningscentrum vid andra sjukhus i Dalian medicinska universitet. Författarna vill tacka Xiao-Lin Sang för hennes hjälp med flödescytometri, och Bo Qu och Dong-Chuan Yang för deras hjälp producera video.
Materials
| BD FACSCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | – | |
| Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | Cat101303 | |
| Champion pET SUMO Protein Expression system | Invitrogen | K300-01 | |
| Custom Gene Synthesis Service | Takara Biotech. | – | |
| DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher | D1306 | |
| F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS | Biolegend | Cat123110 | |
| Leica DMI3000 B Inverted Microscope | Leica Microsystems | – | |
| PE Rat IgG2a, κ-isotype control | Biolegend | Cat400507 | |
| Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution | AAT Bioquest | Cat23125 | |
| Thioglycollate medium | Sigma-Aldrich | T9032 |
References
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. Journal of Visualized Experiments. 98, e52749 (2015).
- Iskander, K. N., et al. Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding. Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).
- Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management. Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).
- Bicker, H., et al. A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria. Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).
- Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. Universal TA cloning. Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).
- Chen, Q., et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Weingart, C. L., et al. Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils. Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).
- Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species. Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).
- Ninkovic, J., Roy, S. High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization. Journal of Visualized Experiments. (93), e52195 (2014).
