תפוקה גבוהה בחוץ גופית הערכה של השהיה היפוך סוכנים על HIV שעתוק ו שחבור
Summary
פרוטוקול תפוקה גבוהה עבור הערכה תפקודית של הפעלה מחדש יעיל HIV ואישור של הפרו-וירוס החבויים תיאר, המיושם על ידי בדיקת ההשפעה של התערבויות ב- HIV שעתוק, שחבור. התוצאות נציג השפעת השהיית היפוך סוכנים על שעתוק מונחה-LTR, החדרת הינם מסופקים.
Abstract
HIV נותר ללא מרפא בשל קיומה של מאגר של תאים זה בנמלים טופס החבויים ויציבה של הנגיף, אשר נשאר בלתי נראה המערכת החיסונית, לא מכוון על ידי טיפול תרופתי הנוכחי (עגלה). שעתוק ו שחבור הוכחו לחזק את השהיה HIV-1 בנח תאי CD4 + T. היפוך של השהיה על ידי שימוש השהיה סוכנים היפוך (LRAs) הגישה “הלם ולהרוג” נחקר בהרחבה, בניסיון לטהר את המאגר הזה, אבל עד כה לא הראה כל הצלחה בניסויים קליניים עקב חוסר התפתחות נאותה קטנים מולקולות יכול ביעילות perturb את המאגר הזה. פרוטוקול המובאת כאן מספק שיטה אמינה ויעילה הערכת השהיה היפוך סוכנים (LRAs) ב- HIV שעתוק של שחבור. גישה זו מבוססת על השימוש הכתב צבע כפול מונחה משמאל לימין בו זמנית יכול למדוד את ההשפעה של חשבון גמלאות אישי על שעתוק ו שחבור על ידי cytometry זרימה. הפרוטוקול המתואר כאן מספיקה עבור תאים חסיד, כמו גם את התאים ההשעיה. זה שימושי לבדיקת מספר רב של תרופות במערכת תפוקה גבוהה. השיטה היא טכנית פשוטה ליישום וחסכונית. בנוסף, השימוש של cytometry זרימה מאפשר להערכת הכדאיות התא, ובכך תרופות רעילות באותו זמן.
Introduction
למרות טיפול תרופתי ארוך טווח יעיל, HIV נמשכת במצב נסתר כמו provirus משולב בזיכרון CD4 + T תאים1. המבנה כרומטין של HIV-1 5′ מסוף זמן חוזר (משמאל לימין) יזם שינויים epigenetic היסטון מתילציה ו deacetylation על ידי ה-DNA methyltransferases (DNMT) ו היסטון deacetylases (HDAC) הם מנגנוני חשוב המוביל דיכוי גנים ברמת השעתוק ובכך השהיה פוסט-אינטגרציה2,3. מגוון גדול של סוכנים היפוך השהיה (LRAs) נחקר על היעילות שלהם לעודד ייצור וירוס במבחנה, לחשוף ויוו מן נגוע מנוחתו CD4 + T תאים4,5,6,7 ,8. בין LRAs נבדק, HDACi (מעכבי HDAC), מעכבי bromodomain ההימור (בו בטיס) זירוז כרומטין decondensation ושחרור של b גורם התארכות שעתוק חיובי (P-TEFb) בהתאמה, שמוביל הבאים להקל על תעתיק דיכוי-5′ LTR והפעלה של HIV ביטוי9,10,11,12,13. עם זאת, סדר הגודל של הפעלה מחדש מושגת על ידי אלה LRAs היה מוגבל רק עלייה צנועה הקשורים תא unspliced HIV mRNA (אותנו RNA), מעידה על שעתוק ויראלי, נצפתה ex-vivo14,15. חשוב לציין, LRAs אלה גם נכשל לזירוז ירידה בשכיחות של תאים נגועים לחשוף.
הביטוי HIV עשוי מוגבלת עוד יותר באמצעות splicing לא יעיל16 , כמו גם פגמים גרעיני הייצוא של הכפל משולבים HIV RNA (MS RNA)17. לפיכך, נדרשים זיהוי שיעורים חדשים של LRAs זה יותר חזקות והוא יכול להשפיע על היבטים שונים של נגיף אינטגרציה שלאחר הייצור. בנוסף, נדרש הפיתוח של מבחני הרומן המסייעים הגדרת תרכובות האופטימלית להפוך ביעילות את זמן השהיה.
. הנה, פרוטוקול מוצג, אשר משתמשת בגישה תפוקה גבוהה להערכה תפקודית של ההשפעה של התערבויות על שעתוק מונחה HIV LTR ו שחבור. בקצרה, דואלי מונחה-LTR חדש צבע הכתב מערכת pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (איור 1) משמש כדי להעריך HIV הפעלה מחדש על ידי cytometry זרימה. כתבת פלורסנט, הביטוי של HIV unspliced mRNA (4kb) מוביל לביטוי משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP), ואילו הביטוי של mRNA משולבים (2 kb) יוביל ביטוי חלבון פלואורסצנטי Discosoma sp. אדום (DsRed). בקצרה, השתמשנו של חלבון כימרי פלורסנט Env-EGFP, gp140unc. ? EGFP, איפה רצף קידוד של EGFP בוצעה במסגרת עם צורה cleaved האו ם, קטום של המעטפה (מעטפה). הוכנסו שינויים כדי ablate האתר המחשוף מונע את הדיסוציאציה של מעטפה עבה לתוך gp120, gp41-EGFP, וכדי לעגל את החלבון gp160 לפני התחום transmembrane יצירת אנלוגי Env מסיסים, המאפשרת את הקיפול הנכון, ביטוי של EGFP. על הביטוי בתוך תא, Rev. רגישה את הגרעין איפה זה שמתווכת גרעיני cytoplasmic הייצוא של 4 kb env mRNA דרך האינטראקציה עם הרכיב להגיב rev (הכנה). העיגול של מעטפה לא מתפשרים על הכנה, הנמצא בין gp120, gp41 A7 3′ אחוי באתר. במערכת זו, החדרת ב- HIV-1 אחוי התורם 4 (SD4), אחוי מקבל 7 (SA7) תוצאות בייצור של 2 קילובתים mRNA קידוד חלבון Rev פונקציונלי נקטע בנקודת חומצת אמינו 38 דבוקה חלבון פלואורסצנטי DsRed, RevΔ38-DsRed. בקצרה, DsRed הוכנס לתוך אקסון 2nd של Rev-חומצת אמינו 38 מאת חפיפה סיומת18. כדי להקל על הייצוא הגרעין של unspliced mRNA, וקטור ביטוי בתרבית של קידוד Rev (pCMV-RevNL4.3) היה שותף transfected עם הבונה כתב פלורסנט (איור 2). המבנה הזה, כתב ייחודי המתוארים כאן הוא שימושי תפוקה גבוהה הערכה של HIV שעתוק שחבור, ללא הצורך להשתמש וקטורים ויראלי.
Protocol
Representative Results
Discussion
לאור הקושי במדידת הפעלה מחדש וירוס ex-vivo, מגוון רחב של במבחנה מודלים שפותחו במהלך הזמן ללימוד השהיה HIV כולל לחשוף נגוע תא T-קווים (J-השרירים, ACH2, U1), מודלים העיקרי של דלקת סמויה של נח ( מודלים O’Doherty, לוין, גרין, Spina) או תאי CD4 + T מופעל מראש (Sahu, מריני, Planelles, Siliciano, מודלים Karn) עם יחיד עגול או שכפול כתב מוכ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט גרנט APP1129320, תוכנית מענק APP1052979 NHMRC של אוסטרליה. אנו מודים ד ר אדם וויטלי, ד ר מרינה אלכסנדר, ד ר ג’ני ל’ אנדרסון ולי י’ מישל על מתן בונה חיוני וייעוץ סיומו המוצלח של עבודה זו. אנו מודים גם הצוות DMI זרימה מתקן עבור שלהם ייעוץ וסיוע נדיב בשמירה על cytometer זרימה השתמשו במחקר זה.
Materials
| Cell culture | |||
| HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells) | ATCC | CRL-3216 | Replicates vectors carrying the SV40 region of replication. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) | Gibco | 10569-010 | + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10099-141 | Origin Australia |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4458 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Trypan blue Stain, 0.4% | Gibco | 15250 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I (1x) reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Serum free medium |
| NucleoBond Xtra Maxi | Marcherey-Nagel | 740414.50 | |
| pEGFP-N1 plasmid | Clontech (TaKaRa) | 6085-1 | Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pDsRed-Express-N1 | Clontech (TaKaRa) | 632429 | Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed | Addgene | 115775 | |
| pCMV-RevNL4.3 | Addgene | 115776 | |
| pCMV-Tat101AD8-Flag | Addgene | 115777 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore | 67-68-5 | |
| JQ1(+) | Cayman Chemical | 11187 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| JQ1(-) | Cayman Chemical | 11232 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 | Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM |
| Phytohaemagglutinin (PHA) | Remel | HA15/R30852701 | Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL |
| Vorinostat (VOR) | Cayman Chemical | 10009929 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM |
| Panobinostat (PAN) | TRC | P180500 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | 63581 | |
| Venor GeM Classic | Minerva Biolabs | 11-1100 | Mycoplasma Detection Kit, PCR-based |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry reagents | |||
| LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow) | |
| LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet) | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34976 | Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit. |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| EDTA 0.5M pH8 | Gibco | 15575-038 | |
| Formaldehyde Solution 37/10 (37%) | Chem-Supply | FA010 | |
| BD FACS Diva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Calibration beads |
| Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks) | BD Biosciences | 559123 | 3.0 – 3.4 mm |
| Sheath solution | Chem-Supply | SA046 | 90 g NaCl in 10 L water |
| HAZ-Tabs | Guest Medical | H8801 | Chlorine release tablets for disinfection |
| Decon 90 | Decon Laboratories Limited | N/A | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%. |
| Sodium Hypochlorite (12-13% Solution) | Labco | SODHYPO-5L | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%. |
| 7x | MPBio | IM76670 | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented) | Corning | 430641U | |
| Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid) | Costar | 3599 | |
| Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid) | Costar | 3896 | |
| Centrifuge tubes (10 mL) | SARSTEDT | 62.9924.284 | 100×16 mm |
| Centrifuge tubes (50 mL) | CellStar | 227261 | 30×115 mm |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Corning Axygen | MCT-150-C | |
| Serological Pipette (25 mL), sterile | Corning | CLS4489-200EA | |
| Serological Pipette (10 mL), sterile | Corning | CLS4488-200EA | |
| Serological Pipette (5 mL), sterile | Corning | CLS4487-200EA | |
| Reagent reservoirs (50 mL), sterile | Corning | CLS4470-200EA | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap | Corning | 352235 | 12 x 75 mm style, 70 mm |
| Nylon Mesh | SEFAR | 03-100/32 | 100 mm |
| Titertube Micro test tubes, bulk | BIO-RAD | 2239391 | microfacs tubes |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap | Corning | 352008 | 12×75 mm style |
| Snap Caps for 12×75 mm Test Tubes | Corning | 352032 | |
| Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik) | ProSciTech | SVZ4NIOU | 3×3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2 |
| Coverslips (Menzel-Gläser) | Grale Scientific | HCS2026 | 20 x 26 mm |
| Microscope | Nikon TMS | 310528 | |
| Centrifuge 5810R refrigerated | Eppendorf | 5811000487 | with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes |
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | N/A | Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| FACS Diva | BD Biosciences | Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1 | |
| FlowJo | FlowJo | FlowJo 10.4.2 | Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481 |
| Omega | BMG Labtech | FLUOstar multi-user reader control, version 5.11 | |
| Omega – Data Analysis | BMG Labtech | MARS | FLUOstar data analysis, version 3.20R2 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Excel:mac 2011 | version 14.0.0 |
| Prism | GraphPad | Prism 7 | version 7.0c |
References
- Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
- Khoury, G., et al. Ch. 8. HIV vaccine and cure – The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine. 1075, (2018).
- Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
- Archin, N. M., et al. HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat. Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).
- Elliott, J. H., et al. Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy. PLoS Pathogens. 10, (2014).
- Leth, S., et al. Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial. The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).
- Rasmussen, T. A., et al. Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial. The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).
- Søgaard, O. S., et al. The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo. PLoS Pathogens. 11, (2015).
- Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein. Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).
- Boehm, D., et al. BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism. Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).
- Contreras, X., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).
- Rasmussen, T. A., et al. Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).
- Wei, D. G., et al. Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071 (2014).
- Blazkova, J., et al. Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy. Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).
- Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo. Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).
- Yukl, S. A., et al. HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing. Science Translational Medicine. 10, (2018).
- Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells. PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).
- Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor. Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).
- Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs. Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).
- Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture. Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).
- Khoury, G., et al. HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications. Retrovirology. 15 (1), 36 (2018).
- Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
- Dahabieh, M. S., et al. Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB. Retrovirology. 11, 17 (2014).
- Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification. Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).
- Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells. PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955 (2015).
- Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements. Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).
- Reeves, M., Sinclair, J. Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).
- Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation. EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).
- Kula, A., et al. Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function. Retrovirology. 8, 60 (2011).
- Kula, A., Marcello, A. Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression. Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).
- Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression. RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).
- Zolotukhin, A. S., et al. PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).
- Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay. Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).
- Cary, D. C., Peterlin, B. M. Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure. F1000Res. 5, (2016).
- Han, Y., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
- Laird, G. M., et al. Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency – reversing drug combinations. Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).
- Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency. Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).
