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Biochemistry

原子力显微镜成像在核细胞结构和动力学研究中的应用

Published: January 31, 2019 doi: 10.3791/58820
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Nebraska Medical Center

Summary

在这里, 我们提出了一个协议, 以表征核糖体粒子在单分子水平上使用静态和延时原子力显微镜 (afm) 成像技术。所描述的表面功能化方法允许在纳米尺度上以高分辨率捕获核糖体的结构和动力学。

Abstract

染色质是一个长链核糖体亚基, 是一个动态系统, 允许 dna 复制和转录等关键过程发生在真核细胞中。核糖体的动力学提供了通过复制和转录机制获得 dna 的机会, 并对染色质功能背后的分子机制做出了重要贡献。单分子研究, 如原子力显微镜 (afm) 成像, 极大地促进了我们目前对核糖体结构和动力学作用的理解。目前的协议描述了使高分辨率 afm 成像技术能够研究核糖体的结构和动态特性的步骤。该协议由获得的 fom 数据说明了集中核细胞的 h3 组蛋白被对应的丝粒蛋白 a (cenp-a) 所取代。该协议从使用连续稀释方法组装单核苷酸体开始。用氨基丙基硅膜 (aps-mica) 功能化制备云母基板, 用于核糖体成像, 对于所描述的核糖体的原子力显微镜可视化至关重要, 并提供了制备底物的程序。沉积在 aps-mica 表面的核细胞首先使用静态 afm 进行成像, 该原子力法捕获核糖体群的快照。通过对这些图像的分析, 可以测量包裹在核糖体上的 dna 大小等参数, 这一过程也是详细的。描述了液体中的延时 afm 成像过程, 描述了高速延时 afm, 它可以捕获每秒多个核糖体动力学帧。最后, 描述和说明了核糖体动力学的分析, 使动态过程的定量表征。

Introduction

在真核细胞中, dna 高度凝聚并组织成染色体。1染色体中 dna 组织的第一级是核糖体的组合, 其中 147 bp 的 dna 紧紧地包裹在一个组蛋白八分体核上。2,3核糖体颗粒聚集在一个长的 dna 分子上, 形成一个染色质阵列, 然后组织起来, 直到形成一个高度紧凑的染色体单元。4染色质的分解提供了基因转录和基因组复制等关键细胞过程所需的免费 dna, 这表明染色质是一个高度动态的系统。5,6,7了解 dna 在不同染色质水平上的动态特性对于阐明分子水平上的遗传过程至关重要, 因为在分子水平上, 错误可能导致细胞死亡或癌症等疾病的发展。8非常重要的染色质性质是核糖体的动力学。9,10,11,12这些粒子的高稳定性使其能够通过晶体学技术进行结构表征。2这些研究缺乏的是核糖体的动态细节, 如 dna 从组蛋白核解包的机制;转录和复制过程所需的动态路径。7.,9,13,14,15,16此外, 被称为重塑因子的特殊蛋白质已被证明有助于核糖体颗粒的分解17;然而, 核糖体的内在动力学是这一过程中的关键因素, 有助于整个拆卸过程。14,16,18,19

单分子荧光技术, 如单分子荧光19、20、21、光学捕获 (推子)13、18、22、23和 afm10,14,15,16,24,25,26在了解核糖体动力学方面发挥了重要作用。在这些方法中, afm 受益于几个独特而有吸引力的功能。afm 允许人们对单个核糖体以及较长的阵列27进行可视化和表征.从 afm 图像中可以测量到组蛋白核周围的 dna 长度等核糖体结构的重要特征; 一个参数, 是核成体解包动力学的表征的核心。过去的 afm 研究表明, 核糖体是高度动态的系统, dna 可以自发地从组蛋白核14中展开。当成像在水溶液14、26、29中进行时, afm 在延时模式下操作, 直接将 dna 从核糖体中解包出来。

高速延时 afm (hs-afm) 仪器的出现使得在毫秒时间尺度14、15、24的时间尺度上可视化核糖体展开过程成为可能。最近 hs-afm 16,30研究的丝粒特异性核糖体揭示了几个新的特点的核糖体相比, 规范类型。中心核细胞组成的丝粒, 染色体的一小部分对染色体分离至关重要 31。与块状染色质中的典型核糖体不同, 丝粒核糖体的组蛋白核心包含 cenp-a组蛋白, 而不是组蛋白 h332,33。由于这种组蛋白取代, dna 包裹在丝粒核糖体中的是 ~ 120 bp, 而不是规范核糖体的 ~ 147 bp;这种差异可能导致着丝粒和规范核糖体数组34的不同形态, 这表明与块状染色体相比, 丝粒染色质经历了更高的动力学。在 hs-afm16中,30项研究所显示的新动力学说明了这种单分子技术为直接可视化其结构和动态特性提供了独特的机会。核糖体。本文最后将简要讨论和说明这些特点的例子。这一进展是由于开发了新的核糖体 afm 成像方案以及对现有方法的修改。这里描述的协议的目标是使这些令人兴奋的进展, 在单分子 afm 核糖体研究的任何人谁想要利用这些技术, 在他们的染色质调查。所描述的许多技术适用于核糖体研究以外的问题, 可用于研究其他感兴趣的蛋白质和 dna 系统。这些应用的几个例子可以在出版物35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49 和 afm研究的前景各种生物分子系统在评论29,50,51, 53,54给出了。

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Protocol

1. 单核细胞的连续稀释组装

  1. 生成和纯化包含一个离中心的 wiom 601 核糖体定位序列的大约 400 bp dna 基板。55
    注: 为了限制二核苷酸的不需要的形成, 定位序列两侧的每个 "手臂" 不应超过 ~ 150 bp。
    1. 使用质粒 pgeem3z-601 与设计的引物一起, 利用 pcr 扩增底粒 dna。对于这里使用的具有122和 154 bp 臂长度的 423 bp 基板, 使用正向 (-catgattatagtatacc-3 ' ') 和反向 (5 '-acagcatgattactacattactacc-3 ') 引物。
    2. 将含有反应混合物的管加入预热至95°c 的热循环器中。在95°c 时初始变性5分钟后运行以下33次循环: 95°c 时30秒的变性, 49°c 时的退火 30秒, 72°c 时延长35秒。在33次循环后, 将最后延展设置为 72°c, 时间为10分钟。
    3. 使用市售的 pcr 纯化试剂盒纯化 pcr 混合物中的 dna。从 pcr 清理柱中洗脱 dna 时, 使用 10 mm tris 缓冲液 (ph 7.5) 代替试剂盒提供的洗脱缓冲液。
      注: 请格外注意, 不要在纯化步骤之间转移缓冲液。在测量 dna 浓度时, 受污染的洗脱液会导致下游出现问题, 或者可能会改变核糖体组合混合物的起始盐浓度。
  2. 通过测量纯化 dna 在260纳米的吸收率来确定 dna 浓度。
    1. 仅使用 10mm tris ph 7.5 洗脱缓冲液, 在 uv vis 分光光度计上收集空白。收集纯化 dna 的测量值。
  3. 在确定浓度后, 纯化后的 dna 中的 aliquot 25 pmol 进入 0.6 ml 微泡管, 并将其放入真空离心机中, 直到溶液几乎看不见为止;这通常是30分钟到1小时。
    注: dna 基板现在已准备好进行核糖体组装。否则, 协议可以在这里暂停, dna 存储在-20°c, 直到使用。
  4. 将含有 25 pmol dna 的微泡管放在冰上, 并按列出的顺序在表 1中添加核糖体组件。添加所有成分后, 将混合物从冰中取出, 在室温 (rt) 下孵育30分钟。
    注: 在计算达到2m 最终浓度所需的氯化钠时, 必须考虑到股票组蛋白缓冲液的含盐量。15,56
  5. 通过连续速率稀释将混合物的2m 盐浓度降低到 200 mm 来组装核糖体。57
    1. 用含有 10mm tris ph 7.5 的100μl 稀释液填充注射器, 并将其放置在注射器泵上。
    2. 将注射器的针头引导通过微孔管盖上的预刺孔, 确保与组件混合物接触 (图 1)。
    3. 以0.75μlcmin 的速度运行注射器泵, 时间为120分钟。
      注: 得到的100μl 溶液含有 250个 nm 核糖体和 200 mm 氯化钠。
    4. 将混合物转移到 10k mwco 透析按钮上, 并在4°c 下对含有 10 mm tris ph 值7.5、0.25 mm edta 和 2.5 mm nocl 的预冷 (4°c) 低盐缓冲液的 200 ml 进行透析, 在4°c 下1小时。
  6. 要评估核糖体组合的组蛋白含量, 请准备一个不连续的 sds-page 凝胶, 其分离率为 15%, 堆叠率为 6%, 如前面所述.
    1. 将核糖体的库存10-20μl 添加到微泡管中, 并将 4x laemmli 样品缓冲器添加到工作浓度为1-2 倍的工作浓度中。58
    2. 作为对照, 在单独的微孔中重复这种制备方法, 以获得1-2 微克的组蛋白库存。在95°c 下加热样品约5分钟。
    3. 在凝胶上相互加载相邻车道上的样品。将示例缓冲区添加到未使用的通道, 以促进均匀的波段迁移。
    4. 运行凝胶在 65 v, 直到染料前部通过堆叠凝胶移动。当分离凝胶达到时, 增加到 150 v, 然后运行, 直到染料前部完全移出凝胶。
    5. 拆卸电泳装置, 轻轻地将凝胶转移到充满 ddh2o 的染色容器中。让凝胶坐5分钟与温柔的搅拌。使用每次使用新鲜的 ddh2o,再重复此过程两次。
      注: 本协议中使用的库马西污渍不需要库马西污渍所需的典型固定步骤 (见材料表)。如果正在使用另一个库马西制剂, 请根据需要调整固定步骤。
    6. 从最后的冲洗中取出水, 并添加足够的污渍来覆盖凝胶。让凝胶以温和的搅拌坐在那里至少1小时。
      注: 对于搅拌, 染色容器可以放置在任何设备上, 促进污渍在凝胶上的运动, 同时也保持凝胶覆盖在液体。
    7. 取下容器上的污渍, 用 dd h2o冲洗凝胶, 更换 ddh2o,用温和搅拌将凝胶浸泡30分钟。(凝胶应如图 2所示, 组蛋白带的明确分离。
  7. 将核糖体存放在 4°c, 直至使用。
    注: 在这些条件下储存时, 核糖体在几个月内保持稳定。协议可以在这里暂停。

2. 云母表面在核细胞静态 afm 成像中的功能

  1. 如图所述, 在去离子水中制备 50 mm 1-(3-氨基丙基) 硅膜 aps 库存溶液。30在4°c 下存放此溶液的1毫升, 直至使用。
    注: 在4°c 条件下, 等价物可以储存一年以上。59
  2. 通过在 15 ml dd h 2 o 中溶解 50 mm aps 库存的 50μl, 制备用于云母改性的工作 aps 1: 300 解决方案.
    注: 此工作解决方案可在室温下储存数天。
  3. 从高品质云母片中切割 1 x 3 厘米的云母条 (见此处使用的云母材料表)。
    1. 检查该作品是否适合时, 对角线放置在一个立方体。使用锋利的推子尖端、剃须刀片或苏格兰胶带, 将云母的层层裂开, 直到两侧都是新鲜的, 并且片被磨成约0.1 毫米 (图 3 a)。立即将云母片放入 aps 填充的 cuvette 中, 孵育 30分钟 (图 3b)。
  4. 将云母片转移到填充 ddh2 o 的立方体中, 浸泡 30秒 (图 3c)。在氩流下完全干燥的 aps-mica 条的两侧。
    注: 无纺布纤维素和聚酯洁净室擦拭 (建议在材料中详细擦拭) 可用于在干燥时从云母边缘吸水。
  5. 现在使用干云母条是用于样品制备。否则, 将工件存放在干净、干燥的立方 (图 3d) 中。
    注: 当环境潮湿时, 建议在真空中额外储存1-2小时。协议可以在这里暂停。

3. 在 aps-云母上制备用于静态 afm 成像的核细胞样品

  1. 将双面胶带涂在几个磁性胶辊上, 并将其放置在侧面。
  2. 将 aps-mica 基板切割成所需的大小 (此处使用的 mm afm 仪器的 1 x 1 厘米正方形)。把这些碎片放在干净的培养皿里, 保持覆盖。
  3. 使用含有 10 mm hepes ph 7.5 和 4 mm mgcl 2 的0.22μm 过滤缓冲液, 制备组装核糖体的三种稀释 (最终核糖体浓度为0.5、1.0 和 2.0 nm)。
    注: 为了限制在低最终浓度下核糖体的损失, 稀释应在 aps-mica 沉积之前一次进行一次。
  4. 将稀释后的核糖体样品在 aps-mica 片的中心保存 5-10μl, 并孵育两分钟。用2-3 毫升的 dd h2o轻轻冲洗样品, 去除所有缓冲成分。每次使用 ~ 0.5 毫升的 dd h2o 后, 轻轻摇晃云母, 去除多余的冲洗水.
    注: 此冲洗步骤建议使用一次性注射器。
  5. 在清洁氩气体的轻流下干燥沉积的样品。
    注: 样品现在已准备好进行成像, 或可以存储在真空机柜或充满氩的干燥器中。按描述制备和储存的样品在制备一年后进行了成像, 没有质量损失。协议可以在这里暂停。

4. 核细胞的静态 afm 成像

  1. 将 afm 尖端安装在刀尖上。使用弹簧常数约为 40 n/m 的尖端和300至 340 khz 之间的谐振频率 (请参阅此处使用的悬臂材料表)。
  2. 将在第3节中制备的样品安装在 afm 阶段, 注意不要接触样品表面。
  3. 将激光放置在悬臂上, 直到总和达到最大值, 并将垂直和侧向偏转值调整为接近零。
  4. 调整 afm 探头以查找其谐振频率, 调整驱动振幅, 并将图像大小设置为 100 x 100 nm。单击参与按钮开始方法。
  5. 接近后, 逐渐优化振幅设置点, 直到可以清楚地看到样品的表面。将扫描大小增加到 1 x 1 微米, 分辨率增加到 512 x 512 像素。单击捕获按钮, 然后单击参与按钮, 开始图像采集。
    注:图 4中的图像显示了在对这些样本进行映像时可以预期的平滑背景。
  6. 要分析核糖体样本, 请使用 afm 仪器分析软件打开捕获的图像。
    1. 使用多项式线减法或类似特征平展图像。
    2. 设置颜色表以反映最小值和最大值的最大值。记录每个图像的这些值, 因为它们将在后面的步骤中需要。
      注: 如果不使用这些值, 则在以后的分析中, 高度数据将不正确, 因为核糖体核心的横截面将显示为相等的高原, 而不是不同的高度。
    3. 将图像导出为原始大小的. tiff 图像。取消选择任何选项, 以使用边框或缩放条保存图像。
    4. 在能够测量轮廓长度的分析软件中打开图像。
    5. 设置 x、y 和 z 比例以匹配图像。
    6. 作为内部长度校准, 测量和记录自由 dna 从一端到另一端的轮廓长度。对于此校准因子, 使用测量值生成直方图, 并将其与法线 (高斯) 分布相匹配。将峰值中心 (xc) 除以基对中的基板长度。
      注: 此值是从纳米到 dna 碱基对的特定图像转换因子。
    7. 测量并记录从手臂自由端到核心中心的每个核糖体的两臂轮廓长度, 以保持一致性 (图 5a)。
    8. 对于每个核糖体核心, 从一对垂直的核心截面测量值中收集两个最大半宽 (fwhm) 值 (图 5b平均值两个 fwhm 测量值, 并从每个核糖体臂中减去结果值的一半纠正从外部输入 dna 到不属于手臂长度的核心中心的测量长度。
    9. 将每个臂的长度除以计算的校准因子 (步骤 4.5.6), 以获取 dna 碱基对中的臂长度。
    10. 通过从未包体基板的总碱基对长度中减去核糖体臂和来计算 dna 包络的程度。将这些值绘制为直方图, 并将峰值与正常 (高斯) 分布相拟, 以获得核糖体群的平均包裹碱基对 dna。
    11. 从测量的截面计算平均核糖体高度。将其绘制为直方图, 并将峰值与正态分布 (高斯) 匹配, 以获得核糖体种群的高度。

5. 核细胞动力学的时移原子力成像

  1. 将 afm 尖端安装在刀尖支架上。可以使用弹簧常数约为 0.1 n/m 和共振频率为7-10khz 的探头 (见此处使用的悬臂的材料清单)。
  2. 使用双棒胶带将 1 x 1 厘米长的 aps-mica 片连接到磁性皮球上, 并将皮球安装在 afm 仪器上。
  3. 在含有 10mm hepes ph 7.5 和 4 mm mgcl 2 的0.22μm 过滤成像缓冲液中, 将核糖体稀释至 1 nm 浓度.
  4. 将稀释后的核糖体在云母片中心保存 5-10μl, 在云母片中心保存 2分钟, 用成像缓冲液的20μl 冲洗沉积样品两次。第二次冲洗后, 在表面保留一滴成像缓冲液。
  5. 使用顶视图相机手动找到尖端和接近表面, 直到尖端是 ~ 100-500μm 从表面。
  6. 添加额外的成像缓冲区, 以填补尖端和表面之间的缝隙。在本例中, 大约50μl 的成像缓冲液足以填补间隙。找到一个共振峰的尖端。
  7. 开始计算机控制的表面处理方法。当接近时, 开始成像与1-2 微米的面积, 以选择一个 ~ 500 纳米的兴趣区域。选择此感兴趣的区域后, 将数据采集密度调整为 512 x 512 像素。
  8. 调整设定点电压和驱动振幅参数, 以提高图像质量。自由振幅为 10 nm 或更小, 扫描速率为 ~ 2 hz, 可用于捕获高质量的图像。图 6显示了使用时移 afm 捕获的核糖体动力学的一个示例。

6. 核细胞动力学的高速时移原子力成像

注: 以下协议是为安藤集团 (日本金泽金泽大学) 开发的 hs-afm 仪器提供的。60

  1. 准备用于液体成像的 aps-mica。
    1. 使用玻璃棒-扫描仪胶 (见材料表) 将玻璃棒连接到 afm 扫描仪阶段。让这个干至少10分钟。
    2. 通过从较大的云母片中对其进行冲孔, 使直径为 1.5 mm 的云母的大小圆片达到约0.1 毫米。使用 hs-afm mica-f开光棒胶 (见材料表) 将云母片连接到 hs-afm 上的玻璃棒上, 然后干燥, 未被触及至少10分钟。使用压敏胶带切割层, 直到在磁带上看到良好的切割层。
    3. 在99μl 的 dd h2o 中稀释 50mm aps 库存的 1μl, 制成 500μm aps 溶液。将该溶液的2.5μl 保存在新鲜的云母表面, 并使功能化30分钟。
      注: 为防止表面干燥, 同时功能化, 50 毫升锥形离心管的瓶盖可与潮湿的滤纸配合, 并放置在扫描仪上。对于液体成像, aps 库存被稀释的次数是静态成像的 3倍, 用于控制动力学, 并以 afm 可以观察到的速度。
    4. 用20μl 的 dd h2o 冲洗云母,用几个 ~ 3μl 冲洗。每次冲洗后, 在云母边缘放置无纺布擦拭物, 将水完全去除。最后冲洗后, 将约3μl 的 dd h2o 放置在表面, 并让它坐至少 5分钟, 以删除任何非特殊绑定的 aps.
  2. 将探头放在 hs-afm 支架上, 并将支架放置在 afm 舞台上, 尖端朝上。使用 ~ 100μl 的 dd h2o 冲洗支架, 然后进行两个 ~ 100μl 过滤核糖的核苷酸体成像缓冲液, 其中包含 10 mm hepes ph 7.5 和 4 mm mgcl2。
  3. 洗完后, 用 ~ 100μl 的核糖体成像缓冲液填充腔内, 将尖端浸入水下。调整悬臂位置, 直到被激光击中。用20μl 的过滤核糖体成像缓冲液冲洗 aps-云母, 每次冲洗使用 ~ 4μl。
  4. 将核糖体组装库存的1μl 稀释为250μl 的过滤核糖体成像缓冲液, 最终核成集浓度为 1 nm。将这种稀释剂沉积在表面 2.5μl, 让它坐 2分钟, 用 ~ 4μl 的核糖体成像缓冲液冲洗表面两次。最后冲洗后, 将表面暴露在成像缓冲液中。
    注: 如果在沉积核糖体样品后不对表面进行冲洗, 表面将迅速变得过度拥挤。
  5. 将扫描仪和样品放在刀尖支架的顶部, 使样品朝下。首先, 使用具有设定点振幅的自动接近函数, a s 接近自由振荡振幅 a0。
    注: 理想情况下, a= 0.95 a0, 但是, 在 a0的82% 运行将工作, 以及如果小心。
  6. 调整设定点, 直到表面被很好地跟踪。
    注: 为了最大限度地减少能量从 afm 尖端转移到核糖体样品, 悬臂梁的振幅应保持在较小的位置, 振幅应低至 1 nm。
  7. 将图像面积设置在 150 x 150 nm 至 200 x 200 nm 左右, 每个成像帧的数据采集速率约为300毫秒。
    注: 此图像大小通常足以同时捕获多个核糖体的动态。填充较少的曲面可能需要更改这些参数。建议的帧速率足以捕获核糖体动力学, 如循环、滑动和展开等 (见下文 "代表性结果" 部分)。

7. 利用时移 afm 捕获核细胞动力学的分析

  1. 将图像从 hs afm 数据类型 (. asd) 转换为. tiff 图像。
    1. 使用 afm 系统的分析软件, 使用平面或线条功能对图像进行平展, 直到背景具有统一的对比度。
    2. 将图像对比度 (颜色刻度) 设置为自动。
      注: 对比度可以手动调整, 以便进行演示, 但不能用于分析。这将导致转换后的图像中的高度详细信息丢失。
    3. 将选定的图像范围另存为. mov 文件。在保存之前, 请取消选择比例栏和边框选项。
      注意: 不要对框架中具有刻度条的图像进行分析。这些会改变图像的大小, 并将导致错误的测量。
    4. 使用合适的软件将. mov 文件转换为图像 (请参阅材料表)。使用与创建. mov 文件时相同的帧速率进行转换。
  2. 对于臂长轮廓测量, 请在具有这种测量类型的测量软件中打开图像 (请参见材料表)。
    1. 设置图像尺寸以匹配捕获图像尺寸的尺寸。
    2. 测量从手臂末端到核糖体核中心的每个核糖体臂的轮廓长度, 并将测量记录在电子表格中 (图 4 a)。
    3. 在核糖体展开后, 测量框架中未包装 dna 底物的长度。使用此方法对用于核糖体包装计算的 nm/bp 比进行特定于影片的校准
    4. 收集核糖体核的两个横截面剖面和裸 dna 的两个横截面剖面 (图 4b)。
    5. 将横截面配置文件导入到电子表格软件中, 并通过从配置文件中的所有点减去最小 z 值来对绘图进行规范化。
    6. 计算每个横截面的最大最大高度和全宽 (fwhm), 并为每个帧的两个轮廓中的值进行平均值。
  3. 从每个核糖体臂中减去一半的 fwhm 值是作为散点图的图形, 以及手臂的计算总和。
    1. 计算核糖体解包后对帧中 dna 进行的 dna 测量的平均轮廓长度。
    2. 通过将游离 dna 的平均轮廓长度除以 dna 基板的碱对长度来确定 nm/bp 校准因子。如第5.12 节所述, 使用此值计算每个帧中的核糖体包装。

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Representative Results

首次为原子力显微镜成像实验使用连续稀释组装方法制备了单核细胞 (图 1)。然后使用不连续的 sds-page 检查制备的核糖体 (图 2)。云母表面是使用 aps 进行功能化的, 它在表面捕获核糖体, 同时保持光滑的背景, 以实现高分辨率成像 (图 3)。核细胞沉积在 aps-mica 上, 并随后使用静态 afm 成像进行了成像。作为对组装和沉积的控制, 利用静态 afm 制备并成像了 h3 单核酶体。h3 单核核糖体的图像 (图 4a) 提供了在沉积前存在的核糖体群的快照, 证实核糖体已成功组装。2 nm 核糖体沉积在表面提供了核成和 dna 颗粒的均匀分布, 很少或没有拥挤。

随着 h3 控制组合的成功, 接下来将所提出的方法应用于 cenp-a 核糖体的研究。此样品的静态 afm 成像 (图 4b) 显示, 该组件是成功的。为了证明核糖体浓度对表面颗粒密度的影响, cenp-a 核糖体沉积在 1 nm (图 4b), 而 h3 使用的为 2 nm (图 4B)。这导致 cenp-a 样品的表面颗粒密度降低到 h3 样品的一半左右。从静态 afm 图像中, 对单核细胞的高度和旋转次数进行了表征 (图 5)。自由 dna 武器和自由 dna 武器的长度之间的角度都被用来确定单个核糖体中 dna 转动的数量。

利用缓冲体中核糖体的延时 afm 成像来可视化核糖体的整体自发解包行为 (图 6)。测量核糖体臂之间的角度和臂的轮廓长度, 以便在此解包过程中确定每个帧中的转弯编号 (图 6 b-c)。随着核糖体的转数减少, 核糖体核心体积也相应减少 (图 6c)。接下来使用高速延时 afm 来探测使用标准延时成像时忽略的更复杂的核糖体动力学。这种技术能够在很长一段时间内捕获动力学, 这对于在 ~ 1200 帧的过程中捕获的 cenp-a 核糖体核 (图 7) 的远距离移位是至关重要的。这项技术对于捕获 cenp-a 核糖体核从一个 dna 基底物到另一个 dna 基板的罕见转移也是至关重要的 (图 8)。快速的图像捕获速率 (~ 300 ms/frame) 使这一动态事件的可视化成为可能, 因为它只需要几个帧即可完成。

表 1: 连续盐梯度核糖体组装所需的试剂.列出的每个成分都被添加到含有纯化 dna 的微泡管中。这应该按照试剂在表中列出的顺序来做, 首先加水和氯化钠, 然后是 h2aeh2b 二聚体和最后添加的组蛋白四聚体。如果要使用预折叠的组蛋白八分体, 请按与上述四聚体相同的比例添加。* 注意每个组蛋白股票中的氯化钠含量, 并相应调整5m 氯化钠添加, 最终的 [氯化钠] 应等于2m。 (请参阅材料表)。

Figure 1
图 1:用于微型核糖体组装的注射器泵原理图.组件混合物的位置与注射器针的末端接触。当稀释缓冲液通过注射器泵输送到装配混合物时, 氯化钠的浓度会降低, 从而促进核糖体的组装。这一数字改编自 stumme-diers等人.30请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 组装核糖体的 sds-page.车道1和2分别包含 h3 表位器和 cenp-a 组蛋白组合。车道3和4分别包含组装的 h3 核糖体和组装的 cenp-a 核糖体。将组装的核糖体与组蛋白的对照仅控制在车道上, 确认核糖体的组装是正确的。每个车道上方的卡通原理图指示存在哪些组蛋白组件。这一数字改编自 stumme-diers等人.30请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 用于核糖体 afm 成像的 aps 功能化云母制备过程示意图.(a) 一块云母 ~ 0.1 毫米厚的云母, 两侧都有新鲜的裂解。(b) 将被切割的云母件迅速对角地放置在含有 aps 溶液的立方体中, 并设置为孵育 30分钟 (c) 按照 aps 功能化步骤, 将 aps-mica 片转移到填充 dd h 2 的立方体中o 为30秒的冲洗。(d) aps-mica 件储存在立方, 直到使用。  请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: h3 和 cnep-a 核糖体的 afm 图像示例.(a) 利用静态 afm 采集的沉积在 aps-mica 上的 h3 单核酶体样本图像。每个明亮的斑点都是一个核糖体核心粒子, 侧翼 dna 区域显示为面条状的手臂。长的面条样特征是自由的 dna 颗粒, 与组蛋白核心无关。对于这张图片, 使用了 2 nm 核糖体浓度, 在表面提供了均匀分布, 几乎没有拥挤。(b) 此核糖体样品沉积在 1 nm, 比 (a) 中使用的 2 nm 的填充量要少得多。这说明了核糖体稀释对核糖体表面密度的直接影响。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 用于表征核糖体颗粒的包装和高度的分析的视觉描述.(a) 图3所示图像中具有代表性的核糖体粒子。每个核糖体手臂的轮廓长度是测量从手臂末端到核心中心 (虚线绿线)。 绘制核糖体的截面剖面 (红色和蓝色线) 产生 (b) 从这些曲线中可以确定粒子的高度和宽度细节。 (c) 核糖体的各种包裹状态示意图。(d) 每个包裹状态的特征都是使用 dna 臂、dna 转动次数和包的 dna 的 bp 之间的角度。刻度条 = 20 纳米。这一数字改编自 lyubchenko等人.24请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6.延时 afm 图像捕捉核糖体自发解包的示例.(a) 一系列连续的 afm 图像, 这些图像是通过在缓冲区中连续扫描捕获的核糖体的自发展开过程。每个帧的大小为 200 nm, 图像以每帧约 170 s 的速度拍摄。(b) 随着每个帧的解包过程的进展, 核糖体的手臂长度增加, (c) 导致 dna 的减少, 围绕核糖体。这个转弯数字可以从测量的手臂长度 (黑色) 或核糖体臂 (红色) 之间的角度来确定。随着转数的减少, 也观察到核糖体体积的减少 (蓝色曲线, 右轴).每帧的大小为 200 x 200 nm。这一数字改编自 lyubchenko等人.24请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 7
图7。演示高速延时 afm 的高容量, 用于长时间的图像采集 ( a) 从1200多个帧中选择的图像库, 展示 cenp-a 核糖体核核的移位行为。每张图像的拍摄速度约为 300 ms/帧。(b) 从 dna 基板的一端到 cenp-a 核的轮廓长度测量被用来表征这一长的移位过程。刻度条 = 25 纳米。这一数字改编自 stumme-diers等人.16 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 8
图8。利用高速延时 afm 捕获的动态核糖体核心转移的例子 (适合于 stumme-diers等人的数字). 16 (a) 显示 cenp-a 核基因从一个 dna 基底物自发转移到另一个 dna 基板的选定帧。这一过程是在几个帧内进行的, 这些帧的速度约为 300 ms/帧。(b) (a) 所示转移过程示意图。刻度条 = 25 纳米。这一数字改编自 stumme-diers等人.16 请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

上述协议相当简单, 并提供了高度可重现的结果, 尽管可以强调几个重要问题。功能化的 aps-mica 是获得可靠和可重复的结果的关键基板。aps-mica 的高稳定性是该基板的重要特性之一, 它允许用户提前准备成像基板以供使用, 可在制备后至少两周内使用。59,61然而, 如果将其用于安装在金属皮球上的云母, 表面可能会被胶的蒸汽损坏。因此, 建议按照协议中的说明 (第2节) 对云母安装使用双棒胶带。在需要使用胶水的情况下, 例如, 一些用户使用胶水将云母安装在金属盘上进行液体成像, 建议使用以下程序, 从6.1.3 部分中描述的程序中修改, 用于 hs-afm 成像的样品制备.云母粘在金属盘或其他固体材料上, 并在胶水凝固后切割。用氩吹至云母, 以去除胶水中潜在的蒸气。然后, 云母可以用苏格兰胶带和 aps 云母的工作溶液进行切割, 以覆盖新鲜的切割云母条。溶液的用量取决于云母条的大小。让 aps 反应30分钟。为了最大限度地减少蒸发, 在湿培养皿中运行反应。使用以下步骤: 浸泡实验室擦拭纸, 放置在培养皿的底部。将5毫米厚的塑料圆盘放在湿巾上, 并将带有粘云母的金属圆盘放在上面, 避免与 petri 盘底部的水接触。30分钟后, 取出微型盘组件, 用 dd 水和移液器彻底冲洗云母表面, 如6.1.3 部分所述。表面已准备好进行样品沉积。aps 浓度需要在 dna 实验中进行调整, 尽管第2.2 节所述的工作 aps 溶液 (1:300) 应该是一个很好的起点。在描述 hs-afm 核糖体成像程序的6.1.3 部分描述的协议中, 使用了三倍高的 aps 浓度 (1:100)。

所描述的协议是基于云母功能化与 aps。这是最可靠、重现性高、简单的过程。唯一的缺点是 aps、氨基丙基硅甲酯不是市售的。然而, aps 合成的过程很简单, 并详细介绍了合成协议。59如果合成过程有问题, 市售可获得的试剂--氨基丙基三乙氧基硅烷 (aptes) 可用于云母功能化 (ap-mica)。本文还提供了利用 aptes 蒸汽制备 AP-mica 的协议。该程序经过测试, 并用于成像病理上不同类型的 dna 35,36,50,62,63和各种蛋白质 dna 复合物, 包括核糖体。27,50,64与 aps-mica 类似, APS-mica 在数周内保持稳定, 可以提前分批制备;AP-mica 表面与 AP-mica 一样光滑, 对缓冲液成分相当不敏感, 因此样品可以在缓冲溶液中制备, ph 值最高可达 ph10, 离子强度在 1 mm 至 200 mm 之间。59,使用AP-mica 的唯一缺点是, 在水中的延时成像过程中, 氨基丙基硅烷有可能在表面的集料中水解和组装, 尽管这一过程与可能存在的集料相当缓慢。在表面上是有区别的, 因此可以获得 dna 的高分辨率图像。35 . silatrane 基团的水解速度非常慢, 因此在长期成像过程中看不到可见的聚集体;26,35,56, 66 因此, 如果在水中进行成像, 与 APS-mica 相比, aps-mica 是较好的底物。为了使用 aptes 的重现性, 强烈建议在制备 AP-mica 时蒸馏试剂。本文第59页介绍了 aptes 蒸馏的方案。

afm 作为一种单分子技术, 在纳米摩尔范围内使用核糖体浓度, 核糖体可以在如此低的浓度下自发分离。根据我们的数据25, 离解过程发生在几十个分钟内, 表明 afm 研究的样本应该在沉积之前准备好。一些洗涤剂, 如 3-[(3-加氨基丙基) 二甲基氨酸]-1-丙基磺酸 (chaps) 增加了核糖体的稳定性, 因此核糖体增加了几个数量级的25, 但使用洗涤剂小心。我们在25 表明, 稳定核糖体伴随着序列特异性的变化, 所以核糖体即使使用这样的序列特异性主题 wiom 601 模板, 组装没有结合601的特异性序列。

相对于其他 afm 样品制备方法, 该方法存在一些重要问题。首先, aps-mica 和 APS-mica 基板在数周内稳定, 可提前分批制备;表面光滑, 对缓冲液组成相当不敏感, 因此样品可以在 ph 值达到 ph10 的缓冲溶液中制备, 离子强度在氯化钠 1 mm 和 200 mm 之间。59,65现有方法都不匹配这些属性。其次, afm 是一种单分子技术, 需要很少的样品。所描述的协议与纳米数量的制剂一起运行。第三, 在延时 afm 研究和 hs-afm 数据采集中, 生成和描述所获得的大型数据集需要大量时间。此处描述的方法非常适合于分析数百张 afm 图像。

样品制备方法并不限于核糖体类型样品。相反, 它对蛋白质-dna 复合物的类型不敏感, 已经被应用于一些蛋白质, 识别 dna 的特定序列, 例如限制酶67,68, 69, 单链 dna结合蛋白44,45,56, 70,71,以及dna 复制中涉及的复杂蛋白质系统47、72和重组68,73。重要的是, hs-afm 已应用于这些系统, 以跟踪这些系统的动态。 这些研究使得有可能将所开发的方法应用于核糖体数组的表征, 并阐明着着着着着着着着着着着着着着着着着着着着着着着着着着着着着着着着着着丝粒蛋白 b (cenp-b) 或 c (cenp-c) 等事在着丝粒体组装中的作用。了解它们在许多癌症发展中的作用33,34。

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Disclosures

提交人声明, 他们没有相互竞争的经济利益。

Acknowledgments

作者贡献: yll 和 msd 设计了该项目;msd 组装核糖体。msd 和 zs 进行了 afm 实验和数据分析。所有作者都撰写和编辑了手稿。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasmid pGEM3Z-601 Addgene, Cambridge, MA 26656
PCR Primers IDT, Coralville, IA Custom Order (FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq polymerase ThermoFischer Scientific, Waltham, MA EP0701 Catalog number for 200 units
PCR purification kit Qiagen, Hilden, Germany  28104 Catalog number for 50 units
Tris base Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 10708976001 Catalog number for 250 g
EDTA ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 15576028 Catalog number for 500 g
(CENP-A/H4)2, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0010 Catalog number for 50 ug
H2A/H2B, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 15-0311 Catalog number for 50 ug
H3 Octamer, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0001 Catalog number for 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 69574 Catalog number for 10 devices
Sodium Chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S9888-500G Catalog number for 500 mg
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters  Millipore-sigma, Burlington, MO UFC501008 Catalog number for 8 devices
HCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 258148-25ML Catalog number for 25 mL
Tricine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T0377-25G Catalog number for 25 g
SDS Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 11667289001 Catalog number for 1 kg
Ammonium Persulfate (AmmPS)  Bio-Rad, Hercules, CA 1610700 Catalog number for 10 g
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 Bio-Rad, Hercules, CA 1610158 Catalog number for 500 mL
TEMED Bio-Rad, Hercules, CA 1610800 Catalog number for 5 mL
4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE Bio-Rad, Hercules, CA 1610747 Catalog number for 10 mL
2-ME Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M6250-10ML Catalog number for 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder  ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 26616 Catalog number for 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie Stain Bio-Rad, Hercules, CA 1610786 Catalog number for 1 L
Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth  TexWipe, Kernersvile, NC TX604
Muscovite Block Mica AshevilleMica, Newport News, VA Grade-1
Aminopropyl silatrane (APS) Synthesized as described in 22
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, MO H4034-25G Catalog number for 25 g
Scotch Tape Scotch-3M, St. Paul, MN
TESPA-V2 afm probe (for static imaging) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy Glue Toagosei America, West Jefferson, OH AA480 Catalog number for 2 g tube
MgCl2 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M8266-100G Catalog number for 100 g
Millex-GP Filter, 0.22 µm Sigma-Aldrich, St. Louis, MO SLGP05010 Catalog number for 10 devices
BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM) Olympus, Japan
Compound FG-3020C-20  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
Compound FS-1010S135-0.5  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
MultiMode Atomic Force Microscope Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA
High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan

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生物化学 第143期 afm 延时 核糖体 染色质 动力学 结构 组蛋白 单分子 dna 表观遗传学 成像
原子力显微镜成像在核细胞结构和动力学研究中的应用
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Stumme-Diers, M. P., Stormberg, T.,… More

Stumme-Diers, M. P., Stormberg, T., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (143), e58820, doi:10.3791/58820 (2019).

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