Aislamiento de células madre mesenquimales del tejido de la pulpa y cocultivo con células de cáncer para estudiar sus interacciones
Summary
Ofrecemos protocolos para la evaluación de las células madre mesenquimales aisladas de la pulpa dental e interacciones de la célula de cáncer de próstata basadas en métodos directos e indirectos de la cultura Co. Condición media y trans-bien membranas son adecuadas analizar actividad paracrina indirecta. Siembra diferencialmente teñidas células juntos es un modelo apropiado para la interacción directa de la célula.
Abstract
Cáncer como un proceso de varios pasos y enfermedad complicada no sólo reglamentado por el crecimiento y proliferación de células individuales sino también controlado por las interacciones de medio ambiente y la célula de tumor. Identificación del cáncer y de las interacciones de la célula de vástago, incluyendo cambios en el ambiente extracelular, interacciones físicas y factores secretados, podría permitir el descubrimiento de nuevas opciones de tratamiento. Combinamos técnicas de cocultivo conocido para crear un sistema modelo para el cáncer de las células madre mesenquimales (MSCs) y las interacciones de la célula. En el estudio actual, las células madre de pulpa dental (DPSCs) y las interacciones de la célula de cáncer de próstata PC-3 fueron examinadas por técnicas de cocultivo directos e indirectos. Medio (CM) de la condición de DPSCs y 0,4 μm tamaño de poro bien trans membranas fueron utilizadas para estudiar la actividad paracrina. Co-cultivo de diversos tipos celulares juntos fue realizado para estudio de la interacción directa de la célula. Los resultados revelaron que CM aumenta la proliferación celular y disminuye la apoptosis en cultivos de células de cáncer de próstata. CM y sistema de trans-así mayor capacidad de migración de la célula de células PC-3. Células teñidas con tintes de membrana diferentes fueron sembradas en los mismos recipientes de cultivo, y DPSCs participó en una estructura autoorganizada con células PC-3 bajo esta condición de la cultura de cooperación directa. En general, los resultados indicaron que técnicas de cocultivo podrían ser útiles para el cáncer y las interacciones de MSC como sistema modelo.
Introduction
Las células madre mesenquimales (MSCs), con la capacidad de diferenciación y contribución a la regeneración de los tejidos mesenquimales como hueso, cartílago, músculo, ligamento, tendón y adiposo, se han aislado de casi todos los tejidos en el cuerpo adulto1 , 2. aparte proveer homeostasis del tejido produciendo células residentes en caso de inflamación crónica o una lesión, que producen vital citoquinas y factores de crecimiento para orquestar la angiogénesis, sistema inmune y tejido remodelación3. La interacción de MSCs con tejido de cáncer no es bien entendida, pero acumulando evidencias de que MSCs pueden promover la iniciación, progresión y metástasis de tumor4.
La capacidad de recalada de MSCs a la zona lesionada o crónicamente inflamada hace un candidato valioso para terapias basadas en células madre. Sin embargo, los tejidos de cáncer, “nunca curar heridas”, también liberación de citoquinas inflamatorias, moléculas de pro-angiogénica y vitales factores de crecimiento, que atraen MSCs cancerígenas zona5. Aunque hay limitada informes que demuestran los efectos inhibitorios de MSCs en cáncer crecimiento6,7la progresión del cáncer y sus metástasis promover efectos han sido ampliamente registrados8. MSCs directa o indirectamente afectan la carcinogénesis de diversas maneras, incluyendo la supresión de las células inmunes, secretando factores de crecimiento/citoquinas que apoyan la proliferación de células de cáncer y la migración, mejorar la actividad angiogénica y regulación transición epitelial-mesenquimal (EMT)9,10. Entorno del tumor consiste en varios tipos celulares, incluyendo fibroblastos asociada al cáncer (CAFs) y miofibroblastos, células endoteliales, adipocitos y células inmunes11. De los cafés son el tipo celular más abundante en la zona de tumor que secretan diferentes quimiocinas promover el crecimiento y metástasis de cáncer8. Se ha demostrado que MSCs de médula ósea pueden diferenciarse en CAF en el estroma tumoral del12.
Células madre de pulpa dental (DPSCs), caracterizadas como el primer MSCs de derivados de tejido dentales por Gronthos et al. 13 en el año 2000 y luego ampliamente investigado por otros14,15, expresar marcadores de pluripotencia tales como Oct4, Sox2y Nanog16 y puede diferenciarse en varios linajes de célula17. Análisis de expresión génica y proteínas demostró que DPSCs producen niveles comparables de factores de crecimiento/citoquinas con otros MSCs como factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), angiogenina, factor de crecimiento fibroblástico 2 (FGF2), interleucina-4 (IL-4), IL-6, IL-10, y factor de células madre (SCF), así como ligando de fms-like tyrosine kinase-3 (Flt – 3L) que puede promover la angiogénesis, modulan las células inmunes y apoyo cáncer célula proliferación y migración de18,19,20 . Mientras que las interacciones de MSCs con entorno de cáncer han sido bien documentadas en la literatura, la relación entre DPSCs y las células de cáncer no ha sido evaluada todavía. En el presente estudio, hemos establecido estrategias de tratamiento medio co-cultivo y condición para una línea celular de cáncer de próstata altamente metastático, PC-3 y DPSCs proponer acción potencial del mecanismo de MSCs dentales en la progresión del cáncer y la metástasis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Contribución de MSCs al entorno del tumor está regulada por varias interacciones incluyendo híbrido celular generación vía celular fusiones, actividades entosis o citoquinas y quimioquinas entre células madre y células de cáncer28. Organización estructural, las interacciones célula-célula y secretadas factores determinan el comportamiento de la célula de cáncer en términos de promoción del tumor, la progresión y la metástasis al tejido circundante. Adecuada ex vivo</e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por la Universidad de Yeditepe. Todos los datos y figuras utilizadas en este artículo fueron previamente publicados34.
Materials
| DMEM | Invitrogen | 11885084 | For cell culture |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | For cell culture |
| PSA | Lonza | 17-745E | For cell culture |
| Trypsin | Invitrogen | 25200056 | For cell dissociation |
| PBS | Invitrogen | 10010023 | For washes |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Component of differentiation media |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G9422 | Component of osteogenic differentiation medium |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | Component of osteo- and chondro-genic differentiation medium |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS −G) | Invitrogen | 41400045 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| TGF-β | Sigma | SRP3171 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| Insulin | Sigma | I6634 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I7018 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Indomethacin | Sigma | I7378 | Component of adipogenic differentiation medium |
| MTS Reagent | Promega | G3582 | Cell viability analyses |
| TUNEL Assay | Sigma | 11684795910 | Apoptotic analyses |
| 24-well plate inserts | Corning | 3396 | For trans-well migration assay |
| PKH67 | Sigma | PKH67GL | For co-culture cell staining |
| PKH26 | Sigma | PKH26GL | For co-culture cell staining |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | For cell fixation |
| von Kossa Kit | BioOptica | 04-170801.A | For cell staining (differentiation) |
| Alcian blue | Sigma | A2899 | For cell staining (differentiation) |
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