Isolamento di cellule staminali mesenchimali da tessuto della polpa e co-coltura con cellule tumorali per studiare le loro interazioni
Summary
Forniamo i protocolli per la valutazione delle cellule staminali mesenchimali isolate da polpa dentale e interazioni delle cellule di carcinoma della prostata basati su metodi diretti e indiretti di co-coltura. Mezzo di condizione e trans-pozzo membrane sono adatte per analizzare attività paracrina indiretta. Seeding differenzialmente macchiato le cellule insieme è un modello appropriato per interazione diretto cellula-cellula.
Abstract
Il cancro come un processo multistep e malattia complicata è non solo regolato da crescita e proliferazione delle cellule individuali ma anche controllato da interazioni cellula-cellula e ambiente del tumore. Identificazione del cancro e cellule staminali interazioni, compresi i cambiamenti nell’ambiente extracellulare, interazioni fisiche e fattori secreti, potrebbe consentire la scoperta di nuove opzioni di terapia. Uniamo le tecniche di co-cultura conosciuta per creare un sistema modello per cancro e cellule staminali mesenchimali (MSCs) interazioni cellula. Nello studio corrente, le cellule staminali della polpa dentale (DPSCs) e interazioni cellula di PC-3 del carcinoma della prostata sono stati esaminati mediante tecniche dirette e indirette di co-coltura. Medio di condizione (CM) ottenuti da DPSCs e 0,4 µm poro dimensioni trans-pozzo membrane sono state usate per studiare l’attività paracrina. Co-coltura di diversi tipi di cellule insieme è stata effettuata per studiare l’interazione diretto cellula-cellula. I risultati hanno rivelato che CM aumentata proliferazione delle cellule ed in diminuzione di apoptosi nelle colture cellulari del carcinoma della prostata. Sia CM e trans-pozzo sistema aumentata capacità di migrazione delle cellule delle cellule PC-3. Le cellule colorate con membrana diversi coloranti erano teste di serie le stesse navi di cultura, e DPSCs ha partecipato a una struttura auto-organizzata con cellule PC-3 in questa condizione di co-coltura diretta. Nel complesso, i risultati hanno indicato che le tecniche di co-coltura potrebbero essere utile per cancro e interazioni di MSC come sistema modello.
Introduction
Cellule staminali mesenchimali (MSCs), con la capacità di differenziazione e contributo alla rigenerazione dei tessuti mesenchimali quali l’osso, cartilagine, muscolo, legamento, tendine e adiposo, sono state isolate da quasi tutti i tessuti nel corpo adulto1 , 2. diversi dalla fornitura dell’omeostasi tissutale producendo cellule residenti in caso di infiammazione cronica o una ferita, che producono vitale citochine e fattori di crescita per orchestrare l’angiogenesi, sistema immunitario ed il tessuto che ritocca3. L’interazione di MSCs con tessuto del cancro non è ben compreso, ma raccogliendo la prova suggerisce che MSCs potrebbe promuovere di iniziazione, la progressione e la metastasi del tumore4.
La capacità di homing delle MSC nell’area lesa o cronicamente inflamed li rende un valido candidato per terapie basate sulle cellule staminali. Tuttavia, nei tessuti tumorali, “mai guarigione delle ferite”, anche rilascio di citochine infiammatorie, molecole pro-angiogenici e fattori di crescita vitale, che attraggono MSCs al cancerogene zona5. Mentre ci sono limitati rapporti che mostrano gli effetti inibitori di MSCs su cancro crescita6,7, loro progressione tumorale e metastasi promuovere effetti sono stati ampiamente riportati8. MSCs direttamente o indirettamente influenzare la carcinogenesi in modi diversi, inclusa l’eliminazione di cellule immunitarie, che secernono le citochine/fattori di crescita che supportano la proliferazione della cellula tumorale e migrazione, migliorando l’attività angiogenica e regolazione transizione epiteliale-mesenchimale (EMT)9,10. Ambiente tumorale è costituito da diversi tipi cellulari fibroblasti cancro-collegati (CAFs) e/o miofibroblasti, cellule endoteliali, adipociti e cellule immuni11. Di quelli, CAFs sono il tipo più abbondante di cellule nella zona del tumore che secernono diverse chemochine, promuovere la crescita e la metastasi di cancro8. È stato dimostrato che MSCs derivate da midollo osseo possono differenziare in CAFs nel tumore dello stroma12.
Cellule staminali della polpa dentale (DPSCs), caratterizzate come il primo MSCs dentale di tessuto-derivato da Gronthos et al. 13 nel 2000 e quindi ampiamente studiato da altri14,15, esprimono marcatori di pluripotenza come Oct4, Sox2, Nanoge16 e possono differenziarsi in varie cellule linages17. Analisi di espressione genica e proteica ha dimostrato che DPSCs produrre livelli comparabili di fattori di crescita/citochine con altri MSCs come fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), angiogenina, fattore di crescita del fibroblasto 2 (FGF2), interleuchina-4 (IL-4), IL-6, IL-10, e fattore di cellula formativa (SCF), così come ligando di chinasi-3 fms-come tirosina (Flt – 3L) che potrebbe promuovere l’angiogenesi, modulano le cellule immuni e sostenere il cancro delle cellule di proliferazione e migrazione18,19,20 . Mentre le interazioni di MSCs con ambiente di cancro sono state ben documentate nella letteratura, il rapporto tra DPSCs e le cellule tumorali non è stato valutato ancora. Nello studio presente, abbiamo stabilito le strategie di trattamento medio di co-cultura e condizione per una linea cellulare altamente metastatica del carcinoma della prostata, PC-3 e DPSCs a proporre azione potenziale del meccanismo di MSCs dentale nella progressione del cancro e metastasi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Contributo di MSCs per ambiente tumorale è regolata da numerose interazioni tra cui ibrido cellulare generazione tramite cella fusioni, Citoplasto o citochine e chemochine attività tra cellule staminali e cancro cellule28. Organizzazione strutturale, interazioni cellula-cellula e fattori secreti determinano il comportamento delle cellule di cancro in termini di promozione del tumore, la progressione e la metastasi al tessuto circostante. Corretto ex vivo sistemi modello per stu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato da Yeditepe University. Tutti i dati e i dati utilizzati in questo articolo sono stati precedentemente pubblicati34.
Materials
| DMEM | Invitrogen | 11885084 | For cell culture |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | For cell culture |
| PSA | Lonza | 17-745E | For cell culture |
| Trypsin | Invitrogen | 25200056 | For cell dissociation |
| PBS | Invitrogen | 10010023 | For washes |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Component of differentiation media |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G9422 | Component of osteogenic differentiation medium |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | Component of osteo- and chondro-genic differentiation medium |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS −G) | Invitrogen | 41400045 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| TGF-β | Sigma | SRP3171 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| Insulin | Sigma | I6634 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I7018 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Indomethacin | Sigma | I7378 | Component of adipogenic differentiation medium |
| MTS Reagent | Promega | G3582 | Cell viability analyses |
| TUNEL Assay | Sigma | 11684795910 | Apoptotic analyses |
| 24-well plate inserts | Corning | 3396 | For trans-well migration assay |
| PKH67 | Sigma | PKH67GL | For co-culture cell staining |
| PKH26 | Sigma | PKH26GL | For co-culture cell staining |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | For cell fixation |
| von Kossa Kit | BioOptica | 04-170801.A | For cell staining (differentiation) |
| Alcian blue | Sigma | A2899 | For cell staining (differentiation) |
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