패치-Clampers에 대 한 연락처 거품 Bilayers 지질 Bilayer 실험

Summary

여기, 선물이 연락처 거품 bilayer 메서드를 사용 하 여 지질 bilayers의 대형을 위한 프로토콜. 물 거품 물-오일 인터페이스에는 단층은 형성 하는 그것에 의하여, 유기 용 매에 불어 진다. 두 펫은 bilayer를 형성 하기 위하여 거품을 도킹 하려면 조작 됩니다.

Abstract

지질 bilayers 수 있도록 다양 한 멤브레인에서 채널 막 상호 작용의 시험 지질 구성 하는 이온 채널의 기능 연구에 대 한 독특한 실험 플랫폼을 제공 합니다. 그 중 물방울 인터페이스 bilayer; 인기를 얻고 있다 그러나, 큰 막 크기 낮은 전기 잡음의 녹음 방해. 우리는 평면 지질 bilayer의 이점을 결합 하는 연락처 거품 bilayer (CBB) 메서드 및 패치 클램프 방법, 지질 구성 변경 하 고 각각 bilayer 기계를 조작 하는 등 설립. 기존의 패치 클램프 실험에 대 한 설치 프로그램을 사용 하 여, CBB 기반 실험 수 쉽게 수행. 간단히, 유리 피 펫에서 전해질 솔루션 단계로 유기 용 매 (hexadecane), 날 려 및 피 펫 압력은 안정 되어 있는 거품 크기를 유지 하 고 있다. 거품은 거품에 리에서 제공 되는 지질 단층 (순수 지질 또는 혼합된 지질), 자발적으로 늘어서 있다. 다음, 두 개의 단층 늘어선 거품 (~ 50 µ m 직경에서) 유리 펫의 팁에서 bilayer 형성에 대 한 도킹 됩니다. 거품으로 채널 재구성 리의 소개 채널 신호 대 잡음 비율 단일 채널 현재 녹음 패치 클램프 기록의 비교를 허용 하는 bilayer의 이끌어 낸다. Cbb는 비대칭 지질 성분과 쉽게 형성 된다. CBB는 이전 거품 밖으로 하 고 새로운 것 들을 형성 하 여 반복적으로 갱신 됩니다. 다양 한 화학 및 물리적 섭 (예를 들어, 막 관류와 bilayer 긴장) Cbb 여기에 부과 될 수 있습니다, 그리고 선물이 CBB 형성에 대 한 기본 절차.

Introduction

이온 채널, 세포 막 하지만 되지 않습니다 단순히 지원 자료 파트너 이온 플럭스를 생성 하기 위한. 기능적으로, 막은 이온 채널 포함, 전기 절연체 이며 모든 세포 막 휴식 막 잠재력으로 헤어 하지 않습니다. 전통적으로, 임의의 막 잠재적인 채널을 통해 전기 전류를 측정 하는 외부 회로에서 부과 되었다. 다른 막 잠재력에 이온 플럭스의 양적 평가이 그들의 이온 선택 투과 등 제어 기능^1,2채널, 분자 속성을 밝혔다. 이온 채널의 기능 연구에 대 한 막 플랫폼 세포 막 또는 지질 bilayer 막입니다. 역사적으로, 단일 채널 전기 현재 녹음 지질 bilayers^3,4에 초연 했다 그리고 패치 클램프 방법 (그림 1A 와 같이 세포 막에 대 한 관련 기술 개발 )^,56. 그 이후,이 두 가지 기술을 다른 목적 (그림 1)^7,8별도로 진화 했습니다.

막 지질 bilayer 막 하 고 현재 채널 단백질의 기능과 구조를 지 원하는 그들의 역할에 대 한 연구의 초점입니다. 따라서, bilayers에 지질 구성을 변경 하는 방법의 준비 여부 수요가입니다. 평면 지질 bilayer (첨 두 부하)^8,,910,11, 물에서 기름 방울 bilayer¹², 드롭릿 인터페이스 bilayer (DIB)^13, 등 지질 bilayer 형성 방법 ^{14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19} 기술 (그림 1) 일반적인 선택, 다양 한 지질 구성²⁰에서 채널 기능을 조사 하기 위한 기회를 제공 하는. DIB는 기술적으로 훨씬 쉽게 기존의 첨 두 부하 보다 생산 하는 DIB의 대형 패치-clampers 단일 채널 현재 녹음 일반적인 크기의 전도도와 공부에 대 한 적용에 대 한 억제 만들었습니다 (< 100 pS).

배경 잡음을 회피, bilayer 영역을 최소화 해야 합니다. 이 문제는 electrophysiological 지질 bilayers (그림 1) 기술 개발 역사의 반복 회상 합니다. 초기에, 소형 bilayer (1-30 µ m 직경에서) 피 펫 (팁-딥 방법;의 끝에 형성 되었다 그림 1 C) ^{21 , 22 , 23}, 보다는 (그림 1B) 챔버에 소수 성 심장에 독립형 bilayer (~ 100 µ m 직경에서)를 사용 하 여. 팁-딥 방법 훨씬 낮은 배경 잡음²⁴전기 측정에 대 한 허용. 우리의 경험 첨 두 부하^25,26, 팁-딥^22,,2327, 및 패치 클램프^{28,,2930, 31} 방법 이끌어 냈다 우리 물에서 기름 bilayer의 원리를 사용 하 여 형성 하는 지질 bilayers의 소설을 생각. 우리는 연락처 거품 bilayer (CBB) 메서드^20,32라고이. 이 방법에서는, 석유 단계 (그림 1D), 물방울 거 보다 물 거품은 날 려 (팁 약 30 µ m의 직경)와 유리 피 펫에서(그림 1와 2), 기름 단계로 어디에 거품은 지속적인 압력을 적용 하 여 유지 됩니다. 거품의 표면에 물-오일 인터페이스에 저절로 단층 양식. 다음, 두 거품 두 유리 펫의 조작을 통해 도킹 하 고 두 monolayers 접근, 서로 평형 bilayer 지역 양보는 bilayer 형성 됩니다. 거품의 크기는 내부 거품 압력 (압력을 들고), 그리고 마찬가지로 bilayer 크기에 의해 제어 됩니다. 50 µ m의 평균 직경은 자주 사용 됩니다. 거품의 볼륨은 작은 (< 100 pL), 대량 전해질 단계 구성 microliter 범위 내에 있는 피 펫 솔루션의 더 큰 볼륨에 연결 된다.

CBB 방법 (표 1)를 사용 하 여 많은 이득이 있다. 지질 bilayer 형성 기술, 다양 한 지질 성분의 세포 막 생성 될 수 있다, 그리고 비대칭 막 더 쉽게 형성된³² 보다 그 기존의 접는 방법³³. bilayer 조작할 수 있습니다 기계적으로, 액체 정역학 압력 차이^34,35으로 구부러진 수 있습니다 기존의 첨 두 부하와는 달리. 지주 압력을 변경 하 여 거품을 확장 하거나 축소, 증가 또는 감소 막 긴장³²로 이어지는. bilayer monolayers, 유사한 형태학 연구, 세포 막의 고정-골절 기법^36,37 에 기계적으로 분리 하지만, CBB 책략 수 반복 분리 하 고 사이클³² 연결에 대 한 . 거품 내 전해질 솔루션의 작은 볼륨 bilayer로 리 채널 재구성의 효율적인 융합 있으며 채널 녹음을 얻기의 확율은 기존의 첨 두 부하 기술 보다 훨씬 높다. 작은 거품 볼륨도 수 (~ 20 ms) 이내 빠른 관류 한번 다른 주입 피펫은 거품 중 하나에 삽입 됩니다. 패치 클램프 방법 달리 즉시 그리고 되풀이 하 여, CBB 막 다시 형성, 일단 하 고 펫 하루에 여러 번 사용할 수 있습니다. 패치 클램프 및 첨 두 부하 방법의 혜택을 통합 하 여는 CBB 제공 하는 막의 물리 화학적 조건을 변경 하는 다양 한 플랫폼 채널 막 상호 작용의 전례 없는 연구에 대 한.

CBB 형성 과정의 상세한 프로토콜을 제시 하기 전에 bilayer 형성의 물리 화학적 배경 막 형성에 관한 실험 어려움을 해결 하기 위해 패치-clampers에 대 한 도움이 될 것입니다 먼저 제시 그는 발생 했습니다.

CBB 실험 표면 화학 과학³⁸의 교훈을 르 친다. CBB는 비누 거품 어디 마찬가지로, 물 거품은 날 려 유기 용 매에는 공중으로 빨 대에서 날 려와 비슷합니다. 한 때 막 지질 물 거품 또는 유기 용 매에 포함 되지 않습니다 물 거품 거의 비정상적 알아차릴 것 이다. Amphipathic 지질의 부재, 물-오일 인터페이스에 표면 장력, 높은 이며 거품 부 대 내 거품 압력 높을 것 이다. 이것은 라플라스 방정식의 실현 (ΔP = 2 γ/R, 어디 ΔP 내부 거품 압력 γ 표면 장력은 이며, R은 거품형 반지름). 유기 단계 또는 전해질 용액에 지질 농도가 높은 경우는 단층에 lipids의 밀도 증가, 깁스 흡착 등온선에 의해 규정 (-dγ = Γ_나 dµ_나, Γ_나 가 표면 초과 화합물의, 그리고 μ_i 은 부품의 화학 잠재력 i)³⁹, 낮은 표면 장력 및 거품 형성의 용이성. CBB는 bilayer 탄젠트 각도 (그림 2)에서 관찰 될 수 있다 고 단층 bilayer 사이의 접촉 각 측정은. 이 각도 단층의 surface tensions와 bilayer 사이 평형 나타냅니다 (젊은 방정식: γ_bi = γ_모 cos(θ), 어디 γ_bi bilayer 긴장, γ_모 단층 긴장 이며 θ 이다 접촉 각). 단층 긴장에 따른 접촉 각 잠재적인 막의 기능으로 평가 되는 접촉 각의 변화 bilayer 긴장에 있는 변화를 나타냅니다 (영 Lippmann 방정식: γ_모 = C_m V² /4 (cos (θ₀)-cos (θ_v)), 어디 C_m 막 용량, V 막 잠재력, 이며 θ₀ θ_v 는 각각 0과 V mV에서 연락처 각도)^{40,41 ,42}. 두 거품은 충분히 가까이, 그들은 접근 서로 자발적으로. 이것은 반 데르 발스 힘 그리고 우리 시각 CBB 형성에서이 동적 과정을 관찰할 수 있다.

CBB 시스템 가지 고유 단계로 구성 됩니다: 즉, 대량 기름 단계는 단층 및 접촉 bilayer (그림 3)으로 거품을 물. 이들은 여러 단계 첨 두 부하, bilayer 단계와 두 개의 monolayers^43,44여 끼여 얇은 유기 단계 용 매 포함 된 토 러 스 등에서 관찰의 연상. CBB에서 단층 단계 bilayer 전단지와 연속 이며 지질 분자 사이는 단층 및 전단지 쉽게 확산. 단층 단계 거품 표면, 지질 저수지 역할 주요 단계 구성의 대부분을 다루고 있습니다. 지질은 단층에서의 소수 성 꼬리 대량 기름 단계에 밖으로 확장, 때문에 bilayer 내부 또는 소수 핵심 대량 기름 단계로 열립니다. 따라서, 소수 성 물질은 bilayer 가까운 석유 단계에 주입 bilayer 인테리어에 쉽게 액세스할 수 있다. 이것은 우리가 개발 했다 최근⁴⁵, 여는 bilayer의 지질 조성 변경 빠르게 (1 초) 이내 단일 채널 현재 녹음 중 막 관류 기술. 우리는 bilayer에 콜레스테롤 내용 역 켜고⁴⁵콜레스테롤 관류를 전환 하 여 통제 될 수 발견. 관련 물질의 농도 기온 변화도 연수 효과^46, 로 알려져 있는 유포를 통해 즉시 해산 단층 bilayer에 관련 된 물질의 농도 차이가, 그 ⁴⁷. 다른 한편으로는 monolayers에 걸쳐 플립플롭은 느린^48,,4950.

CBB 메서드를 사용 하는 bilayer 1 낮은 전해질 pH 등 다양 한 물리 화학적 조건 형성은 ⁵¹, 3 M까지 (⁺K, Na⁺)소금 농도, ±400 mV, 높은 막 잠재력 및 시스템 최대 60 ° c.의 온도

있다는 CBB의 형성에 대 한 몇 가지 옵션 및 채널 분자의 거기에. 물-오일 인터페이스에서 단층의 형성, 대 한 지질 (지질-아웃 방법; 유기 용 매에 추가 됩니다. 그림 4 A, 4 C) 또는 리 (지질에 방법;으로 거품 그림 4 B, 4 D)입니다. 특히, 지질에서 메서드는 비대칭 막^15,32의 형성에 대 한 수 있습니다. 채널 단백질으로 재구성 되는 반면 채널 분자 (예를 들어, 채널을 형성 하는 펩 티 드) 수성 해결책에서 녹는 거품 (그림 4A, B)^52,53에 직접 추가 리 거품 (그림 4C, D)에 추가 됩니다. 여기, 채널 펩타이드 (polytheonamide B (pTB); 지질 방법에 의해 Cbb의 형성 그림 4 A) 또는 단백질 (KcsA 칼륨 채널, 그림 4C) 표시 됩니다.

Protocol

1. 리 준비 원하는 농도 (예를 들어, 10 mg/mL)에 클로 프롬에 인지질 (예를 들어, 가루에 10 mg)을 분산. 클로 프롬을 증발. 장소는 둥근 바닥 플라스 크 및 회전 하는 증발 기에는 N2 가스 실린더에 연결 ( 테이블의 자료를 참조) 설정에서 인지질 솔루션. 상 온에서 N2 흐름 아래 플라스 크를 돌려 얇은 인지질 영화 (~ 30 분) 후 나타납니다….

Representative Results

전형적인 CBB (그림 56) 50 µ m의 직경 졌고 hexadecane에 특정 막 커패시턴스 0.65 μ F/c m2했다. 거품 크기는 임의로 내부 거품 압력에 의해 제어 됩니다. 작은 거품은 저 잡음 기록에 필요한 팁 직경 대응 하 게 작은 되어야 합니다. 예를 들어 직경에서 50 µ m의 거품 크기, 팁 직경 30 µ m 이어야 합니다. <p class="jove_content" fo:keep-together.wi…

Discussion

지질 bilayer 형성의 CBB 메서드 단층²⁰줄지어 물에 기름 방울의 원리를 기반으로 합니다. 기술적으로, Cbb 형성에 대 한 절차는 쉽게, 특히 패치 클램프 연구자, 유리 micropipettes 조작에 능숙 합니다. Microinjectors와 함께 두 개의 피 펫 조작자 사용할 수 있을 때 패치 클램프에 대 한 electrophysiological 설치 쉽게는 CBB에 사용 됩니다. 다른 한편으로는 CBB 기존의 첨 두 부하의 후임은, 때문에 …

Materials

Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S)	Sigma-Aldrich	P3644
A/D Converter	Molecular Divices	Digidata1550A
Ag/AgCl electrode	Warner Instruments	64-1317
Bath Sonicator	Branson	M1800H-J
Camera	Hamamatsu Photonics	C11440-10C
Glass Capillary	Harvard Apparatus	30-0062
Hepes	Dojindo	342-01375
Hole Slideglass	Matsunami Glass	S339929
Inverted Microscope	Olympus	IX73
Isolation Table	Herz	TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor	Narishige	IM-11-2
Micro Manipulator	Narishige	EMM
Microforge	Narishige	MF-830
Micropipette holder
n-Hexadecane	Nacalai	07819-32
Patch-Clamp Amplifier	HEKA	EPC800
Pipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-87
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)	Avanti Polar Lipids	850457
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine )	Avanti Polar Lipids	850757
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) )	Avanti Polar Lipids	840457
Potassium Chloride	Nacalai	28514-75
Rotary Evapolator	Iwaki	REN-1000
Succinic Acid	Nacalai	32402-05
Vacuum Pump	Buchi	V-100