Lípidos bicapa experimentos con bicapas de burbuja contacto para parche-abrazaderas

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para la formación de bicapas lipídicas soportadas utilizando un método de contacto burbuja bicapa. Se sopla una burbuja de agua en un solvente orgánico, por el que se forma una monocapa en la interfase agua-aceite. Dos pipetas son manipulados para acoplar las burbujas para formar una bicapa.

Abstract

Bicapas de lípidos proporcionan una plataforma experimental única para estudios funcionales de los canales iónicos, permitiendo el examen de las interacciones membrana-canal bajo membrana varias composiciones de lípidos. Entre ellos, la bicapa de la interfaz de gota ha ganado popularidad; sin embargo, el tamaño grande de la membrana impide la grabación de bajo ruido eléctrico. Hemos establecido un método de contacto burbuja bicapa (CBB) que combina los beneficios de la bicapa lipídica planar y métodos de la abrazadera del remiendo, como la capacidad para variar la composición de lípidos y de manipular a los mecánicos de la bicapa, respectivamente. Usando la configuración para los experimentos de patch-clamp convencionales, experimentos basados en el CBB se pueden fácilmente realizar. En Resumen, la solución de un electrolito en una pipeta de vidrio está fundida en una fase solvente orgánica (hexadecano), y la presión de la pipeta se mantiene para conseguir un tamaño de burbuja estable. La burbuja está llena espontáneamente de una monocapa de lípidos (lípidos puros o mezcla de lípidos), que se proporciona de liposomas en las burbujas. A continuación, se acoplan las dos burbujas revestimiento de monocapa (~ 50 μm de diámetro) en la punta de las pipetas de vidrio para la formación de la bicapa. Introducción de liposomas canal reconstituido en la burbuja conduce a la incorporación de canales en la bicapa, lo que permite un canal grabación actuales con una relación señal a ruido comparable a la de grabaciones de patch-clamp. CBB con una composición asimétrica de los lípidos se forma fácilmente. El enganche se renueva varias veces soplar las burbujas anteriores y formando otras nuevas. Diversas perturbaciones químicas y físicas (e.g., perfusión de membrana y la bicapa tensión) pueden ser impuestas en el CBB. adjunto, presentamos el procedimiento básico para la formación del CBB.

Introduction

De canales iónicos de la membrana celular no es simplemente un material de apoyo sino un socio para generar el flujo de iones. Funcionalmente, la membrana es un aislador eléctrico en que ion canales están integrados, y todas las membranas celulares son impartidas con un potencial de membrana de reposo. Convencionalmente, se impuso una potencial arbitrario de la membrana de un circuito externo por el cual se midió la corriente eléctrica a través de los canales. Esta evaluación cuantitativa del flujo de iones en potenciales de membrana diferentes reveló las propiedades moleculares de estos canales, como su permeabilidad ion selectivo y bloquea funciones^1,2. La plataforma para estudios funcionales de los canales iónicos de membrana es la membrana celular o la membrana de bicapa lipídica. Históricamente, solo canal eléctricas actuales grabaciones se realizaron primero en bicapas de lípidos^3,4, y las técnicas relevantes fueron desarrolladas para las membranas celulares, como el método de patch-clamp (figura 1A )^5,6. Desde entonces, estas dos técnicas han evolucionado por separado para diferentes propósitos (figura 1)^7,8.

Lípidos de membrana y membranas bicapa son actualmente el foco de investigación para su papel en el apoyo a la estructura y función de proteínas de canal. Por lo tanto, la disponibilidad inmediata de los métodos para variar la composición de lípido en bicapas está en alta demanda. Lípidos bicapa formación métodos, como la plana lípidos bicapa (PLB)^8,9,10,11, gota de agua en aceite bicapa¹²y gota interfaz bicapa (DIB)^{13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19} técnicas (figura 1) son opciones comunes, proporcionando una oportunidad para examinar la función de canal en diferentes composiciones de lípidos²⁰. Aunque el DIB es técnicamente mucho más fácil de producir que la PLB convencional, el gran tamaño de la DIB ha creado un desincentivo para abrazaderas de parche aplicar para el estudio de grabaciones actuales monocanal con conductancia generalmente tamaño (< 100 pS).

Para evitar el ruido de fondo, debe minimizarse el área de la bicapa. Este tema recuerda las repeticiones de la historia en el desarrollo de técnicas electrofisiológicas para bicapas de lípidos (figura 1). En los primeros días, una bicapa de pequeño tamaño (1-30 μm de diámetro) se formó en la punta de una pipeta (método de inmersión en punta; Figura 1 C) ^{21 , 22 , 23}, en lugar de usar una bicapa independiente (~ 100 μm de diámetro) en un tabique hidrofóbico en una cámara (figura 1B). El método de inmersión en punta para mediciones eléctricas con mucho más bajo de ruido de fondo²⁴. Nuestras experiencias con^25,26de PLB, punta-dip^22,23,27y abrazadera del remiendo^{28,29,30, 31} métodos nos llevaron a una idea novedosa de formar bicapas de lípidos mediante el uso de los principios de la bicapa de agua en aceite. Nos hemos referido a esto como la burbuja contacto método bicapa (CBB)^20,32. En este método, en lugar de colgar las gotitas de agua en una fase de aceite (figura 1D), una burbuja de agua está fundida de una pipeta de vidrio (con diámetro de punta de aproximadamente 30 μm) en la fase de aceite (figura 1E y 2), donde el la burbuja se mantiene mediante la aplicación de una presión constante. Una forma de capa monomolecular espontáneamente en la interfase agua-aceite en la superficie de la burbuja. A continuación, dos burbujas se acoplan a través de la manipulación de dos pipetas de vidrio y la bicapa está formada como las dos monocapas aproximan, dando un área de bicapa de equilibrio. El tamaño de la burbuja es controlado por la presión intra-burbuja (con presión) y además el tamaño de la bicapa. Con frecuencia se utiliza un diámetro promedio de 50 μm. Aunque el volumen de la burbuja es pequeño (< 100 pL), está conectado con el mayor volumen de la solución de la pipeta que está en la gama de microlitro, constituyendo la fase de electrólito a granel.

Hay muchos beneficios al utilizar el método de enganche (tabla 1). Como una técnica de formación de bicapa lipídica, pueden producir membranas de varias composiciones de lípidos y membranas asimétricas son más fácilmente formada³² que son los del método plegable convencional³³. La bicapa se puede manipularse mecánicamente, a diferencia de la PLB convencional que sólo se puede doblar con una diferencia de presión hidrostática^34,35. Cambiando la presión de la tenencia, las burbujas expansión o encogen, conduciendo a aumento o disminución de la membrana de tensión³². La bicapa es mecánicamente desmontable en monocapas, similares a la congelación de la fractura técnica^36,37 de membranas en estudios morfológicos, pero con el enganche, una maniobra permite separar y fijar ciclos³² repetidos . El pequeño volumen de la solución electrolítica dentro de la burbuja permite eficiente fusión de liposomas canal reconstituido en la bicapa, y la probabilidad de obtener grabaciones de canal es mucho mayor que con la técnica convencional de la PLB. El volumen de la burbuja pequeña también permite perfusión rápida (dentro de ~ 20 ms) inyección una vez otra pipeta se introduce en cualquiera de las burbujas. A diferencia del método de la abrazadera del remiendo, una vez roto, una membrana CBB nuevamente se forma inmediatamente y en varias ocasiones, y pipetas pueden utilizarse varias veces al día. Mediante la integración de beneficios de los métodos de la PLB y abrazadera del remiendo, el enganche esférico proporciona una plataforma versátil para variar las condiciones fisicoquímicas de la membrana, permitiendo estudios sin precedentes de las interacciones membrana-canal.

Antes de presentar un protocolo detallado del proceso de formación de CBB, el fondo fisicoquímico de la formación de la bicapa se presenta primero, que será útil para parche-abrazaderas resolver las dificultades experimentales relativos a la formación de la membrana se encuentran.

Experimentos CBB imparten lecciones de química superficial ciencia³⁸. El CBB es similar a una burbuja de jabón soplada de una pajita en el aire, donde además, se sopla una burbuja de agua en un solvente orgánico. Uno notará que una burbuja de agua apenas se infla cuando lípidos de membrana no están incluidos en la burbuja de agua o en solvente orgánico. En la ausencia de lípidos anfipáticos, la tensión superficial en una interfase agua-aceite es alta y la presión intra-burbujas para soplar una burbuja será alta. Se trata de una realización de la ecuación de Laplace (ΔP = γ/R 2, donde ΔP es la presión intra-burbuja, γ es la tensión superficial y R es el radio de la burbuja). Cuando la concentración de lípidos en la fase orgánica o en la solución de electrolitos es alta, aumenta la densidad de los lípidos en la monocapa, dictadas por el isoterma de adsorción de Gibbs (-dγ = Γ dµ, donde Γ es el exceso de superficie del compuesto i y μ es el potencial químico del componente i)³⁹, conduce a una baja tensión superficial y facilitar la formación de burbujas. En el enganche, la bicapa puede ser observada desde un ángulo tangencial (figura 2), y el ángulo de contacto entre el monocapa y bicapa es mensurable. Este ángulo representa un equilibrio entre la surface tensions de la monocapa y bicapa (ecuación joven: γ_bi = γ_mo cos(θ), donde γ_bi es la tensión de la bicapa,_mo γ es la tensión de la monocapa, y θ es el ángulo de contacto). Los cambios en el ángulo de contacto indican cambios en la tensión de la bicapa, ya que la tensión de la monocapa se evalúa de los cambios en el ángulo de contacto en función de la membrana potencial (ecuación Young-Lippmann: γ_mo = C_m V² /4 (cos (θ₀) – cos (θ_v)), donde C_m es la capacitancia de la membrana, V es el potencial de membrana y θ₀ y θ_v son los ángulos de contacto 0 y V mV, respectivamente)^{40,41 ,42}. Cuando dos burbujas se encuentra lo suficientemente cercanas, se acercan entre sí espontáneamente. Esto es debido a las fuerzas de van der Waals, y visualmente podemos observar este proceso dinámico de formación de CBB.

Un sistema CBB consta de distintas fases: a saber, una fase de aceite a granel, agua burbujas recubiertas con una capa monomolecular y una bicapa contacto (figura 3). Estos son una reminiscencias de las múltiples fases observadas en un PLB, como un toro que contiene el solvente en la fase de la bicapa y una fase orgánica fina intercalada por dos monocapas^43,44. En el enganche, la fase de monocapa es continua con el folleto de la bicapa, y moléculas de lípidos fácilmente difusión entre el monocapa y el folleto. La fase de monocapa cubre la mayor parte de la superficie de la burbuja, que constituye la fase principal que sirve como un reservorio de lípidos. Ya que la cola hidrofóbica de los lípidos en la monocapa se extiende hacia afuera a la fase de aceite a granel, el interior de la bicapa o el núcleo hidrofóbico se abre a la fase de aceite a granel. Así, una sustancia hidrofóbica que inyecta en la fase de aceite cerca de la bicapa es capaz de acceder fácilmente al interior de la bicapa. Esta es la técnica de perfusión de membrana que habíamos desarrollado recientemente⁴⁵, por la que la composición de lípidos de la bicapa se cambia rápidamente (dentro de un segundo) durante grabaciones actuales de un canal. Encontramos que el contenido de colesterol en la bicapa puede ser reversible controlado por conectar/desconectar la perfusión de colesterol⁴⁵. En caso de que la concentración de la sustancia en la monocapa y bicapa difiere, el gradiente de la concentración de la sustancia se disuelve inmediatamente a través de la difusión, que se conoce como el efecto de Marangoni^{46, 47}. por otra parte, flip-flop a través de los monocapas son lento^48,49,50.

Usando el método de enganche, la bicapa está formada bajo condiciones fisicoquímicas versátiles, como un pH del electrolito como 1 ⁵¹, una concentración de sal (K⁺, Na⁺, etcetera.) hasta 3 M, un tan alta como ±400 mV del potencial de la membrana y un sistema de temperatura de 60 ° C.

Hay varias opciones para la formación de la CBB y la incorporación de moléculas de canal en el mismo. Para la formación de la monocapa en la interfase agua-aceite, se añaden lípidos en un disolvente orgánico (método de lípidos; Figura 4 A, C 4) o en una burbuja como liposomas (método de lípidos; Figura 4 B, 4 D). En particular, el método de lípidos permite la formación de membranas asimétricas^15,32. Moléculas de canal solubles en solución acuosa(por ejemplo, el canal formando péptidos) se agregan directamente en la burbuja (figura 4A, B)^52,53, mientras que las proteínas de canal son reconstituidas en liposomas, que se añaden en la burbuja (figura 4C, D). En este documento, la formación de CBB por el método de lípidos para un péptido canal (polytheonamide B (pTB); Figura 4 A) o una proteína (canal de potasio de la emisora KcsA, figura 4C).

Protocol

1. preparar liposomas Dispersar los fosfolípidos (por ejemplo, 10 mg en polvo) en cloroformo a una concentración deseada (p. ej., 10 mg/mL). Evaporar el cloroformo. Lugar la solución de fosfolípidos en un matraz de fondo redondo y el conjunto en un evaporador rotatorio (véase Tabla de materiales) conectado a un cilindro de gas N2 . Gire el frasco bajo el flujo de N2 a temperatura ambiente hasta que aparezca una película fina de fos…

Representative Results

Un enganche típico tenía un diámetro de 50 μm (figura 56) y la capacitancia de membrana específicos en hexadecano fue 0.65 μF/cm2. El tamaño de la burbuja fue arbitrariamente controlado por la presión intra-burbuja. Cuando pequeñas burbujas son necesarias para grabaciones de poco ruido, el diámetro de la punta debe ser correspondientemente pequeño. Por ejemplo, para un tamaño de burbuja de 50 μm de diámetro, el diáme…

Discussion

El método de enganche de la formación de la bicapa de lípidos se basa en el principio de una gotita de agua en aceite, revestido por una monocapa²⁰. Técnicamente, los procedimientos para la formación de CBB son fáciles, especialmente para los investigadores de la abrazadera del remiendo, que son expertos en manipular Micropipetas de vidrio. La configuración electrofisiológica para la abrazadera del remiendo se utiliza fácilmente en el CBB cuando dos manipuladores de la pipeta con microman…

Materials

Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S)	Sigma-Aldrich	P3644
A/D Converter	Molecular Divices	Digidata1550A
Ag/AgCl electrode	Warner Instruments	64-1317
Bath Sonicator	Branson	M1800H-J
Camera	Hamamatsu Photonics	C11440-10C
Glass Capillary	Harvard Apparatus	30-0062
Hepes	Dojindo	342-01375
Hole Slideglass	Matsunami Glass	S339929
Inverted Microscope	Olympus	IX73
Isolation Table	Herz	TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor	Narishige	IM-11-2
Micro Manipulator	Narishige	EMM
Microforge	Narishige	MF-830
Micropipette holder
n-Hexadecane	Nacalai	07819-32
Patch-Clamp Amplifier	HEKA	EPC800
Pipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-87
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)	Avanti Polar Lipids	850457
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine )	Avanti Polar Lipids	850757
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) )	Avanti Polar Lipids	840457
Potassium Chloride	Nacalai	28514-75
Rotary Evapolator	Iwaki	REN-1000
Succinic Acid	Nacalai	32402-05
Vacuum Pump	Buchi	V-100