Isolasjon, rensing, og differensiering av Osteoclast forløpere fra Rat Bone marg

Summary

Osteoklaster er vev-spesifikke macrophage polykaryons avledet fra monocytt-macrophage avstamning av blodkreft stamceller. Denne protokollen beskriver hvordan du isolerer benmargceller slik at store mengder osteoklaster oppnås samtidig redusere risikoen for ulykker som finnes i tradisjonelle metoder.

Abstract

Osteoklaster er store, multinucleated, og Ben-resorbing celler av monocytt-macrophage avstamning som er dannet av fusjon av monocytter eller macrophage forløpere. Overdreven bein resorpsjon er en av de mest betydningsfulle cellulære mekanismer som fører til osteolytiske sykdommer, inkludert osteoporose, periodontitt, og periprosthetic osteolysis. Den viktigste fysiologiske funksjon av osteoklaster er å absorbere både hydroksyapatitt mineral komponent og organisk matrise av bein, genererer den karakteristiske resorpsjon utseende på overflaten av bein. Det er relativt få osteoklaster sammenlignet med andre celler i kroppen, spesielt i voksen bein. Nyere studier har fokusert på hvordan å få mer modne osteoklaster på kortere tid, som alltid har vært et problem. Flere forbedringer i isolasjon og kultur teknikker har utviklet seg i laboratorier for å oppnå mer modne osteoklaster. Her introduserer vi en metode som isolerer benmargen på kortere tid og med mindre anstrengelse i forhold til den tradisjonelle prosedyren, ved hjelp av en spesiell og enkel enhet. Med bruk av tetthet gradient sentrifugering, får vi store mengder av fullt differensiert osteoklaster fra rotte benmarg, som er identifisert av klassiske metoder.

Introduction

Bone homeostase er en kompleks fysiologisk prosess som er regulert av Ben-resorbing osteoklaster og bein-forming osteoblaster¹. En balanse mellom osteoblastaktivitet og osteoclastic aktivitet formidlet gjennom osteoblaster og osteoklaster, henholdsvis, er svært viktig for å opprettholde bein helse og homeostase, fordi forstyrrelser i bein homeostase kan føre til bein sykdommer, slik som unormal bein vekst eller tap av bentetthet. Som unike Ben-resorpsjon celler, osteoklaster er viktige i sykdommer knyttet til unormal bein ødeleggelse, inkludert osteoporose, periodontitt, og periprosthetic osteolysis^2,3.

Utviklingen av en osteoclast kultur er i hovedsak delt inn i to etapper. Metodene etablert av Boyde et al.⁴ og Chambers et al.⁵ komponerte den første etappen på 1980-tallet. De fikk relativt rikelig osteoklaster fra bein av nyfødte dyr, som er den raske remodeling perioden. Osteoklaster er utgitt av fragmentering og stirring beina i et spesielt medium. Men cellene innhentet av denne metoden er lav i kvantitet og renhet. Den andre fasen var utviklingen av langtrekkende kulturer av osteoclast formasjon, bruker blodkreft avstamning celler avledet fra benmarg⁶. Cytokiner, som 1 α, 25-dihydroxyvitamin D3, prostaglandin E2 (PGE-2), og parathyroid hormon (PTH), som er lagt inn i kulturen medium, handle gjennom systemet av osteoblaster/stromal celler for å stimulere osteoclast formasjon^7,8 . Imidlertid kan renheten og mengden av osteoklaster innhentet av denne metoden ikke oppfyller behovene til moderne molekylærbiologi forskning. Deretter oppdagelsen av macrophage koloni-stimulerende Factor (M-CSF) og reseptor aktivator for kjernefysisk faktor-KB ligand (RANKL) gjør osteoclastogenesis enklere^9,10,11, og metoden for å bruke M-CSF og RANKL å direkte stimulere osteoclast formasjon er mye brukt rundt om i verden. Det er imidlertid fortsatt noen detaljer i metodikken som må forbedres.

Foreløpig den mest brukte osteoclast kultur metoden, som beskrevet av Marino et al.¹² og Pei et al.¹³, ofte krever fjerning av omkringliggende vev rundt benet og bruker en sterilisert nål for å skylle margen hulrom med fullførte medier. Det er noen ulemper med denne prosessen, inkludert det faktum at (1) fjerning av omkringliggende vev rundt benet krever mye tid og stor kirurgisk teknikk, (2) beina er skjøre og kan føre til benmarg utløp, (3) benmargen hulrom kan være for liten til å spyle, og (4) det er en risiko for nål Stick skade. For å unngå disse problemene, sentrifuger vi rørene som inneholder bein for benmarg i stedet for nål-Flushing benmargen. Her introduserer vi en stabil og sikker metode som isolerer benmargen på kortere tid og med mindre anstrengelse i forhold til den tradisjonelle prosedyren. Sammen med bruk av tetthet gradient sentrifugering, får vi store mengder av fullt differensiert osteoklaster in vitro.

Protocol

Alle metodene som involverer dyrene er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) av Nanjing University of Chinese Medicine. 1. oppsett Forbered flere lengderetningen klipp 1 mL pipette tips (1 cm) og flere 1,5 mL mikrosentrifugen rør. Sett pipette tips og mikrosentrifugen rør ved 103 kPa og 121 ° c i 20 min og sikre at de er sterile. Forbered en eske med is og flere sterile retter for å bevare det isolerte vevet under isolasjons p…

Representative Results

Formålet med protokollen var å isolere og rense et stort antall osteoclast forløpere bekvemt og indusere osteoklaster vellykket. Ved å supplere med M-CSF og RANKL ble gigantiske osteoklaster sett på dag 5 – 6. Dannelsen av osteoklaster ble vellykket identifisert ved TRAP farging (figur 1a). Store og lilla celler ble betraktet som TRAP-positive celler med flere kjerner (vanligvis ≥ tre kjerner). Gjennom denne metoden var det typisk å skaffe 800 osteo…

Discussion

Evnen til å skaffe og studere osteoklaster in vitro er en kritisk og grunnleggende ferdighet for enhver forsker som ønsker å studere bein metabolisme, som kan bidra til å forstå mekanismene for Ben-absorberende sykdommer og utvikle romanen terapeutiske midler. Den foreliggende studien beskrev en protokoll med noen modifikasjoner basert på tidligere metoder.

Ved å bruke pipette tips og mikrosentrifugen rør for å få benmarg, det i stor grad redusert operasjonstiden for å skaffe benmar…

Materials

Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit	Sigma-Aldrich	387A
Automatic Hard Tissue Slicer	Lecia	RM2265
Bovine femoral bone			Purchased by ourselves
Cell Incubator	Heraus	BB16/BB5060
Fetal Bovine Serum	Sarana	s-fbs-au-015
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077
Hard Tissue Grinders	Lecia	SP-2600
Histopaque Kit	TianJing Haoyang	TBD2013DR	Silicified centrifugal tube amd cell separation solution
Hochest33342	Sigma-Aldrich	B2261
Inverted Phase Contrast Microscope	Olympus	CKX31
Inverted Fluorescence Microscope	Lecia	DMI-3000
MEM, no Glutamine	Gibco	11090-081
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Gibco	15140122
Rabbit Anti-Calcitonin receptor	Bioss	bs-0124R
Recombinant Rat M-CSF	PeproTech	400-28
Recombinant Rat sRANK Ligand	PeproTech	400-30
Red Blood Cell Lysis Buffer	Absin	abs47014932
Scanning Electron Microscopy	FEI	Quanta 200
Toluidine Blue	Sigma-Aldrich	89649