Isolatie, zuivering en differentiatie van osteoclast precursoren van het Rat beenmerg
Summary
Osteoclasten zijn weefsel-specifieke macrofagen polykaryons afgeleid van de monocyten-macrofagen afstamming van hematopoietische stamcellen. In dit protocol wordt beschreven hoe u beenmergcellen isoleren zodat grote hoeveelheden osteoclasten worden verkregen terwijl het risico op ongevallen in traditionele methoden wordt verminderd.
Abstract
Osteoclasten zijn grote, multinucleaire, en resorbing cellen van de monocyten-macrofagen lijn die gevormd worden door de fusie van monocyten of macrofagen precursoren. Overmatige been resorptie is een van de meest significante cellulaire mechanismen die leiden tot osteolytic ziekten, waaronder osteoporose, parodontitis, en periprosthetic osteolyse. De belangrijkste fysiologische functie van osteoclasten is het absorberen van zowel de hydroxyapatiet minerale component en de organische matrix van het bot, het genereren van de karakteristieke resorptie verschijning op het oppervlak van de botten. Er zijn betrekkelijk weinig osteoclasten in vergelijking met andere cellen in het lichaam, vooral in volwassen botten. Recente studies hebben zich gericht op hoe meer volwassen osteoclasten te verkrijgen in minder tijd, die altijd al een probleem. Verschillende verbeteringen in de isolatie en cultuurtechnieken hebben ontwikkeld in laboratoria om meer volwassen osteoclasten te verkrijgen. Hier introduceren we een methode die het beenmerg isoleert in minder tijd en met minder inspanning in vergelijking met de traditionele procedure, met behulp van een speciaal en eenvoudig apparaat. Met het gebruik van dichtheidsgradiënt centrifugeren, krijgen we grote hoeveelheden van volledig gedifferentieerde osteoclasten van Rat beenmerg, die worden geïdentificeerd door klassieke methoden.
Introduction
De homeostase van het been is een complex fysiologisch proces dat door been-resorbing osteoclasten en been-vormt osteoblasten1wordt geregeld. Een evenwicht tussen osteoblastic en osteoclastic activiteit bemiddeld door osteoblasten en osteoclasten, respectievelijk, is zeer essentieel voor het behoud van gezondheid van de botten en homeostase, omdat verstoringen in het bot homeostase zou kunnen leiden tot bot ziekten, zoals Als abnormale beengroei of verlies van botdichtheid. Als unieke Bone-resorptie cellen, osteoclasten zijn belangrijk in ziekten in verband met abnormale bot vernietiging, met inbegrip van osteoporose, parodontitis, en periprosthetic osteolyse2,3.
De ontwikkeling van een osteoclast cultuur is hoofdzakelijk verdeeld in twee stadia. De methoden opgericht door Boyde et al.4 en Chambers et al.5 componeerde de eerste fase in de jaren 1980. Zij verkregen vrij overvloedige osteoclasten van de beenderen van pasgeboren dieren, die de snelle het remodelleren periode is. Osteoclasten worden vrijgegeven door het versplinteren en roeren de botten in een speciaal medium. Echter, de cellen verkregen door deze methode zijn laag in hoeveelheid en zuiverheid. De tweede fase was de ontwikkeling van lange-afstands culturen van osteoclast vorming, met behulp van hematopoietische Lineage cellen afgeleid van beenmerg6. Cytokines, zoals 1α, 25-dihydroxyvitamine D3, prostaglandine E2 (PGE-2), en bijschildklier hormoon (pth), die worden toegevoegd in de cultuurmedium, handelen via het systeem van osteoblasten/stromale cellen te stimuleren osteoclast vorming7,8 . Echter, de zuiverheid en kwantiteit van osteoclasten verkregen door deze methode niet kan voldoen aan de behoeften van de moderne moleculaire biologie onderzoek. Dan is de ontdekking van de macrofagen Colony-stimulerende factor (M-CSF) en receptor Activator voor nucleaire factor-κB ligand (Rank) maken osteoclastogenesis makkelijker9,10,11, en de methode van het gebruik van M-CSF en RANKe om direct te stimuleren osteoclast vorming wordt veel gebruikt over de hele wereld. Er zijn echter nog enkele details in de methodologie die moeten worden verbeterd.
Momenteel is de meest gebruikte osteoclast cultuurmethode, zoals beschreven door Marino et al.12 en Pei et al.13, vereist vaak de verwijdering van het omliggende weefsel rond het bot en maakt gebruik van een gesteriliseerde naald om de mergholte spoelen met voltooide media. Er zijn een aantal nadelen aan dit proces, met inbegrip van het feit dat (1) de verwijdering van het omliggende weefsel rond het bot vergt veel tijd en grote chirurgische techniek, (2) de botten zijn kwetsbaar en kan leiden tot beenmerg uitstroom, (3) het beenmerg Holte zou kunnen worden te klein om te spoelen, en (4) is er een risico van naald stok letsel. Om deze problemen te voorkomen, centrifugeren we de buizen met de botten voor het beenmerg in plaats van naald-blozen het beenmerg. Hier introduceren we een stabiele en veilige methode die het beenmerg isoleert in minder tijd en met minder inspanning in vergelijking met de traditionele procedure. Samen met het gebruik van dichtheidsgradiënt centrifugeren, krijgen we grote hoeveelheden van volledig gedifferentieerde osteoclasten in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
De bekwaamheid om osteoclasten in vitro te verkrijgen en te bestuderen is een kritieke en fundamentele vaardigheid voor om het even welke onderzoeker die beenmetabolisme wil bestuderen, die kan helpen de mechanismen van been-absorberende ziekten begrijpen en nieuwe therapeutische agenten ontwikkelen. De huidige studie beschreef een protocol met een aantal wijzigingen op basis van eerdere methoden.
Door het gebruik van pipet tips en microcentrifuge buizen om het beenmerg te verkrijgen, verminde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de nationale stichting van de natuurwetenschappen van China (81473692) aan Yong ma. De auteurs danken alle medewerkers van het medisch onderzoekscentrum van het eerste college van klinische geneeskunde in Nanjing universiteit van de Chinese geneeskunde.
Materials
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Automatic Hard Tissue Slicer | Lecia | RM2265 | |
| Bovine femoral bone | Purchased by ourselves | ||
| Cell Incubator | Heraus | BB16/BB5060 | |
| Fetal Bovine Serum | Sarana | s-fbs-au-015 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| Hard Tissue Grinders | Lecia | SP-2600 | |
| Histopaque Kit | TianJing Haoyang | TBD2013DR | Silicified centrifugal tube amd cell separation solution |
| Hochest33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Inverted Phase Contrast Microscope | Olympus | CKX31 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Lecia | DMI-3000 | |
| MEM, no Glutamine | Gibco | 11090-081 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| Rabbit Anti-Calcitonin receptor | Bioss | bs-0124R | |
| Recombinant Rat M-CSF | PeproTech | 400-28 | |
| Recombinant Rat sRANK Ligand | PeproTech | 400-30 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Absin | abs47014932 | |
| Scanning Electron Microscopy | FEI | Quanta 200 | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89649 |
References
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level. Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).
- Park, S. J., et al. Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption. Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).
- Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro. British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).
- Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts. Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).
- Takahashi, N., et al. Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures. Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).
- Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. Modulation of osteoclast differentiation. Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).
- Yoshida, H., et al. The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene. Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).
- Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
- Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. Generation and culture of osteoclasts. BoneKEy Reports. 3, 570 (2014).
- Pei, J. R., et al. Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression. Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).
- Arnett, T. R., Dempster, D. W. Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro. Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).
- Arnett, T. R., et al. Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption. Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).
- Orriss, I. R., Arnett, T. R. Rodent osteoclast cultures. Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).
- Quinn, J. M., et al. Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts. Bone. 25 (1), 1-8 (1999).
