Les ostéoclastes sont des polycaryons macrophages spécifiques aux tissus dérivés de la lignée monocyte-macrophages des cellules souches hématopoïétiques. Ce protocole décrit comment isoler les cellules de la moelle osseuse afin que de grandes quantités d’ostéoclastes soient obtenues tout en réduisant le risque d’accidents que l’on retrouve dans les méthodes traditionnelles.
Les ostéoclastes sont de grandes cellules multinucléées et de résorbage osseux de la lignée monocyte-macrophages qui sont formées par la fusion de monocytes ou de précurseurs de macrophages. La résorption osseuse excessive est l’un des mécanismes cellulaires les plus significatifs conduisant à des maladies ostéolytiques, y compris l’ostéoporose, la parodontite et l’ostéolyse périprosthétique. La principale fonction physiologique des ostéoclastes est d’absorber à la fois la composante minérale de l’hydroxyapatite et la matrice organique de l’OS, générant l’aspect de la résorption caractéristique sur la surface des os. Il ya relativement peu d’ostéoclastes par rapport à d’autres cellules dans le corps, en particulier dans les os adultes. Des études récentes ont porté sur la façon d’obtenir des ostéoclastes plus matures en moins de temps, ce qui a toujours été un problème. Plusieurs améliorations dans les techniques d’isolement et de culture se sont développées dans les laboratoires afin d’obtenir des ostéoclastes plus matures. Ici, nous introduisons une méthode qui isole la moelle osseuse en moins de temps et avec moins d’effort par rapport à la procédure traditionnelle, à l’aide d’un dispositif spécial et simple. Avec l’utilisation de la centrifugation par gradient de densité, nous obtenons de grandes quantités d’ostéoclastes entièrement différenciés de la moelle osseuse de rat, qui sont identifiés par des méthodes classiques.
L’homéostasie osseuse est un processus physiologique complexe qui est régulé par des ostéoblastes de résorbage osseux et des ostéoclastes formant des os1. Un équilibre entre l’activité ostéoblastique et l’ostéoclaste induite par les ostéobenzènes et les ostéoclastes, respectivement, est très essentiel pour maintenir la santé osseuse et l’homéostasie, car les perturbations de l’homéostasie osseuse peuvent entraîner des maladies osseuses, telles comme une croissance osseuse anormale ou une perte de densité osseuse. En tant que cellules uniques de résorption osseuse, les ostéoclastes sont importantes dans les maladies liées à la destruction osseuse anormale, y compris l’ostéoporose, la parodontite et l’ostéolyse périprosthétique2,3.
Le développement d’une culture ostéosclast est principalement divisé en deux étapes. Les méthodes établies par Boyde et coll.4 et Chambers et coll.5 composaient la première étape dans les années 1980. Ils ont obtenu des ostéoclastes relativement abondantes à partir des os des animaux nouveau-nés, qui est la période de remodelage rapide. Les ostéoclastes sont libérés par la fragmentation et l’agitation des os dans un milieu spécial. Cependant, les cellules obtenues par cette méthode sont faibles en quantité et en pureté. La deuxième étape a été le développement de cultures à longue distance de formation d’ostéoclast, utilisant des cellules de lignée hématopoïétique dérivées de la moelle osseuse6. Les cytokines, telles que la 1 α, la 25-dihydroxyvitamine D3, la prostaglandine E2 (PGE-2) et l’hormone parathyroïde (PTH), qui sont ajoutées dans le milieu de culture, agissent par l’intermédiaire du système des cellules ostéoblastes/stromales pour stimuler la formation d’ostéoclast7,8 . Cependant, la pureté et la quantité d’ostéoclastes obtenues par cette méthode ne peuvent pas répondre aux besoins de la recherche moderne en biologie moléculaire. Ensuite, la découverte du facteur stimulant des colonies de macrophages (M-CSF) et de l’activateur du récepteur pour le ligand nucléaire de facteur-κB (RANKL) rend l’ostéoclastogenèse plus facile9,10,11, et la méthode d’utilisation de m-CSF et RANKL pour stimuler directement la formation d’ostéosclast est largement utilisé dans le monde entier. Cependant, il y a encore quelques détails dans la méthodologie qui doivent être améliorés.
Actuellement, la méthode de culture d’ostéoclast la plus couramment utilisée, telle que décrite par Marino et al.12 et PEI et al.13, nécessite souvent l’enlèvement du tissu environnant autour de l’os et utilise une aiguille stérilisée pour rincer la cavité médullaire avec les médias complétés. Il y a quelques inconvénients à ce processus, y compris le fait que (1) l’enlèvement du tissu environnant autour de l’OS nécessite beaucoup de temps et une grande technique chirurgicale, (2) les os sont fragiles et peuvent conduire à l’écoulement de la moelle osseuse, (3) la cavité de la moelle osseuse pourrait être trop petit pour rincer, et (4) il y a un risque de blessure de bâton d’aiguille. Pour éviter ces problèmes, nous centrifuger les tubes contenant les os pour la moelle osseuse au lieu de l’aiguille-rinçage de la moelle osseuse. Ici, nous introduisons une méthode stable et sûre qui isole la moelle osseuse en moins de temps et avec moins d’effort comparé à la procédure traditionnelle. Avec l’utilisation de la centrifugation par gradient de densité, nous obtenons de grandes quantités d’ostéoclastes entièrement différenciés in vitro.
La capacité d’obtenir et d’étudier les ostéoclastes in vitro est une compétence critique et fondamentale pour tout chercheur souhaitant étudier le métabolisme osseux, qui peut aider à comprendre les mécanismes des maladies absorbant les os et à développer de nouveaux agents thérapeutiques. La présente étude décrivait un protocole avec quelques modifications fondées sur des méthodes antérieures.
En utilisant des pointes de pipette et des tubes de microcentrifugation pour ob…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation de la Chine (81473692) à Yong ma. Les auteurs remercient tout le personnel du centre de recherche médicale du premier collège de médecine clinique à l’Université de la médecine chinoise de Nanjing.
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
Automatic Hard Tissue Slicer | Lecia | RM2265 | |
Bovine femoral bone | Purchased by ourselves | ||
Cell Incubator | Heraus | BB16/BB5060 | |
Fetal Bovine Serum | Sarana | s-fbs-au-015 | |
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
Hard Tissue Grinders | Lecia | SP-2600 | |
Histopaque Kit | TianJing Haoyang | TBD2013DR | Silicified centrifugal tube amd cell separation solution |
Hochest33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
Inverted Phase Contrast Microscope | Olympus | CKX31 | |
Inverted Fluorescence Microscope | Lecia | DMI-3000 | |
MEM, no Glutamine | Gibco | 11090-081 | |
Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
Rabbit Anti-Calcitonin receptor | Bioss | bs-0124R | |
Recombinant Rat M-CSF | PeproTech | 400-28 | |
Recombinant Rat sRANK Ligand | PeproTech | 400-30 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer | Absin | abs47014932 | |
Scanning Electron Microscopy | FEI | Quanta 200 | |
Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89649 |