Lucifer Yellow-en robust Paracellulær permeabilitet markør i en celle model af humant blod-hjerne barrieren
Summary
Vi præsenterer en fluorescens analyse for at påvise, at Lucifer Yellow (LY) er en robust markør til at bestemme den tilsyneladende paracellulære permeabilitet af hCMEC/D3 Cell monolayers, en in vitro model af den menneskelige blod-hjerne barriere. Vi brugte denne analyse til at bestemme kinetikken af en konfluent enkeltlags dannelse i kulturperler hcmec/D3 celler.
Abstract
Blod-hjerne barrieren BBB består af endotelceller, der danner en barriere mellem det systemiske kredsløb og hjernen for at forhindre udveksling af ikke-væsentlige ioner og giftige stoffer. Stramme kryds (TJ) forsegle effektivt det paracellulære rum i monolag resulterer i en intakt barriere. Denne undersøgelse beskriver en ly-baseret fluorescens analyse, der kan anvendes til at bestemme dens tilsyneladende permeabilitet koefficient (Papp) og til gengæld kan bruges til at bestemme kinetikken af dannelsen af konfluent monolag og den resulterende stramme Junction barriere integritet i hCMEC/D3-monolayers. Vi demonstrerer yderligere en ekstra nytte af denne analyse for at bestemme TJ funktionel integritet i transficeret celler. Vores data fra LY Papp assay viser, at hCMEC/D3 celler seedet i en transwell setup effektivt begrænse ly paracellular transport 7 dage-post kultur. Som en ekstra nytte af den præsenterede analyse, vi også påvise, at DNA nanopartikel transfektering ikke ændrer sig paracellulær transport i hcmec/D3 monolayers.
Introduction
Blod-hjerne barrieren (BBB) er den beskyttende barriere, der begrænser tilstrømningen af plasma komponenter til hjernevæv og består af hjerne endotelceller sammen med understøttende celler som pericytes. Den vigtigste rolle BBB er at tjene som en barriere, der forsegler rummet mellem perifert blod og centralnervesystemet (CNS) for at opretholde hæmostase af neurale mikromiljø1,2. Hjernen kapillær endotelceller forsegle effektivt paracellulære pathway via dannelse af intercellulære stramme kryds (TJs)1. Denne beskyttende barriere tillader glukose og udvalgte næringsstoffer til at komme ind i hjernen, mens det forhindrer de fleste ioner, giftige stoffer og narkotika fra passerer gennem denne stramme barriere. Bortset fra sin beskyttende rolle, den naturlige barriere funktion af BBB udgør en alvorlig udfordring i udviklingen af narkotika levering systemer rettet mod CNS.
In vitro cellekultur modeller af BBB er nyttige værktøjer til at studere sin biologi og til at forstå virkningerne af narkotikabehandling på TJ barriere integritet. Vi brugte den humane cerebral microvaskulære endotel cellelinje (hcmec/D3) som en in vitro-model, da det er en accepteret model af menneskelig hjerne endotelet3 og rekapitulerer mange funktioner i den menneskelige BBB. hcmec/D3is en af de mest almindeligt anvendte cellelinjer til modellering af BBB in vitro4,5,6,7,8,9. På trods af sin forholdsvis lave værdier af transendothelial elektrisk modstand (TEER), et mål for barriere tæthed, denne cellelinje bevarer de fleste af de morfologiske og funktionelle egenskaber af hjernen endotelceller, selv som en monokultur i fravær af dyrkede gliale celler6,7. Hcmec/D3-celle linjen udtrykker flere BBB-markører, herunder aktive transportører og receptorer indtil ca. passage 35 uden at gennemgå dedifferentiering til ustabile fænotyper6,7,9 ,10,11. Den mest slående Karakteristik af hcmec/D3 cellelinje som en in vitro BBB model er dens evne til at danne tjs5,9,11,12. Det skal bemærkes, at selv stamcelle-afledte BBB modeller viste højere permeabilitet i mange undersøgelser sammenlignet med hCMEC/D3 cellelinje og de udtrykker nogle BBB markører, de er endnu ikke at udvikle sig som den mest almindeligt BBB celle model13. Vigtigere, stamcelle afledte BBB modeller mangler at være karakteriseret med hensyn til maksimale passage numre, der tillader cellerne at opretholde stabile BBB fænotyper14.
Tre primære metoder er almindeligt anvendt til at bestemme TJ barriere integritet, herunder måling af teer, måling af tilsyneladende permeabilitet koefficient (Papp) af små hydrofile Tracer molekyler såsom saccharose, inulin, Lucifer gul, etc. og immun farvning af kendte molekylære markører af TJs såsom claudin-5, ZO-1, occludin, etc.5. Teer er en forholdsvis enkel og kvantitativ metode, der måler den elektriske modstand på tværs af cellen monolag dyrket på en porøs membran substrat5. TEER-værdier kan dog påvirkes af eksperimentelle variabler såsom sammensætningen af dyrkningsmediet og typen af måleinstrument. En sandsynlig kombination af disse faktorer fører til en bred fordeling af TEER værdier, der spænder fra 2 til 1150 Ω cm2 i hCMEC/D3-celle linjen, som dyrkes i 2-21 dage13. Immunofarvning er en visuel metode til at bestemme tilstedeværelsen af TJ proteiner ved at mærke det målrettede protein ved hjælp af antistoffer. Immun farvning involverer imidlertid en række eksperimentelle trin, herunder behovet for at fastsætte/permeabilize celler, der kan resultere i eksperimentelle artefakter, og de fluorescerende signaler kan falme over tid. Ovennævnte faktorer kan føre til subjektive fejl, der påvirker datakvaliteten.
Det primære fokus for dette arbejde er at præsentere en ly-baseret tilsyneladende permeabilitet analyse bestemme kinetikken af en flydende enkeltlags dannelse i dyrkede hcmec/D3 celler. Selv om andre avancerede in vitro-BBB-systemer, såsom Co-Culture-systemer, mikrofluidisk-systemer, er fysiologisk mere relevante efterligner med signifikant forbedret barriere funktion15,16,17, hcmec/D3 transwell setup er en enkel og pålidelig model til at estimere kinetikken af TJ dannelse og hurtigt screene virkningen af forskellige lægemiddel formuleringer på barriere funktion. Generelt er P-app- værdierne konsistente for forskellige hydrofilic-opløfter i hCMEC/D3-monolayers. For eksempel er de rapporterede P-app- værdier for forskellige lavmolekylære opløsningsmidler (såsom saccharose, Mannitol, ly osv.) i forskellige in vitro-BBB-modeller i rækkefølgen 10-4 cm/min5,18,19 , 20. i vores eksperimentelle opsætning, er hjernens endotelceller seedet på en kollagen-belagt Mikroporøs membran til celle fastgørelse og enkeltlags dannelse for at efterligne in vivo barrieren. Den tilføjede i den apikale side forventes at krydse de intercellulære stramme knude og ophobes i den basolaterale side. Større koncentrationer af LY i den basolaterale side indikerer en umoden, ikke-fuldt funktionel barriere, mens lavere koncentrationer afspejler begrænset transport på grund af tilstedeværelsen af funktionelle TJs, hvilket resulterer i en moden barriere.
LY er en hydrofile farvestof med særskilte excitation/emission toppe og undgår behovet for radioaktive Tracer molekyler som saccharose, Mannitol eller inulin. Således kan fluorescens værdier af LY bruges til direkte at beregne sin paracellulære permeabilitet på tværs af BBB monolayers. Sammenlignet med mange kommercielt tilgængelige farvestoffer, der anvendes i biomedicinske områder, der lider af små Stokes Skift såsom fluorescein21, er Stokes Shift of ly ca. 108 nm med tilstrækkelig spektral adskillelse, hvilket giver mulighed for at fluorescens data som en robust aflæsning for at bestemme den paracellulære permeabilitet. Vi brugte Western blotting som en ortogononal teknik til at demonstrere ændringer i udtryk for den stramme Junction markør protein, ZO-1, over kultur tid. ZO-1 udtryk detekteret via Western blotting bruges til at supplere ly Papp data og i kombination, disse data tyder på, at de observerede ændringer i ly papp værdier er reflekterende af dannelsen af en enkeltlags med gradvis stigning i udtryk for den stramme samle markør, ZO-1.
Som påpeget tidligere, det centrale fokus for dette arbejde er at demonstrere en ly analyse som en simpel teknik til at overvåge dannelsen af en flydende enkeltlags med funktionelle stramme kryds. Men for at demonstrere en ekstra nytte af den udviklede assay, vi målte LY Papp i DNA nanopartikel-transfected hCMEC/D3 monolayers. Nukleinsyrer kan kondenseres i polyelektrolyt nanopartikler med en diameter på 100-200 Nm via elektrostatisk interaktion mellem de positivt ladede grupper af polymerer og de negativt ladede fosfat grupper af nukleinsyrer22, 23. vi refererer til disse KOMPLEKSER som DNA nanopartikler (DNA NPS) i vores arbejde. Mens vores hensigt er at transficere celler og udtrykke det ønskede protein, skal vi sikre, at barriereegenskaberne af hcmec/D3 monolag ikke kompromitteres. Vores data tyder på, at en standard 4 h der gen transfektering regime ikkemålelig ændre den ly permeabilitet demonstrere nytten af ly Papp assay til at bestemme ændringer i TJ barriere integritet.
Protocol
Representative Results
Discussion
En central rolle i BBB er at forhindre udveksling af ikke-væsentlige ioner og giftige stoffer mellem det systemiske kredsløb og hjernen til at opretholde hæmostase af neurale mikromiljø. Et af de karakteristiske træk ved BBB er evnen af de kapillar endotelceller til at danne stramme kryds (TJs), der effektivt forsegle den paracellulære rute transport. Vi demonstrerede en LY Papp assay som en kvantitativ metode til at bestemme den tilsyneladende KINETIK af TJ barriere dannelse i kulturperler hCMEC/D3 mono…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne er taknemmelige for den finansielle støtte fra 2017 nye investigator Award fra American Association of Pharmacy, en Hunkele frygtede sygdom Award fra Duquesne University og School of Pharmacy start-up midler til Manickam laboratorium. Vi vil gerne takke Læklaboratoriet (Duquesne University) for Western blotting assistance og tillade brug af deres Odyssey 16-bit Imager. Vi vil også gerne inkludere en særlig påskønnelse af Kandarp Dave (Manickam Laboratory) for at få hjælp til Western blotting.
Materials
| hCMEC/D3 cell line | Cedarlane Laboratories | 102114.3C-P25 | human cerebral microvascular endothelial cell line |
| gWizLuc | Aldevron | 5000-5001 | Plasmid DNA encoding luciferase gene |
| lucifer yellow CH dilithium salt | Invitrogen | 155267 | |
| Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes | Falcon | 353095 | |
| Tissue culture flask | Olympus Plastics | 25-207 | |
| 24-well Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-107 | |
| Black 96-Well Immuno Plates | Thermo Scientific | 437111 | |
| S-MEM 1X | Gibco | 1951695 | Spinner-minimum essential medium (S-MEM) |
| EBM-2 | Clonetics | CC-3156 | Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) |
| phosphate-buffered saline 1X | HyClone | SH3025601 | |
| Collagen Type I | Discovery Labware, Inc. | 354236 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Cell Culture Lysis 5X Reagent | Promega | E1531 | |
| Beetle Luciferin, Potassium Salt | Promega | E1601 | |
| SpectraMax i3 | Molecular Devices | Fluorescence Plate Reader | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher | 61-7300 | |
| anti-GAPDH antibody | abcam | ab8245 | |
| Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L) | Jackson ImmunoResearch Inc | 128817 | |
| 12-well, Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-106 | |
| RIPA buffer (5X) | Alfa Aesar | J62524 | |
| Aprotinin | Fisher BioReagents | BP2503-10 | |
| Odyssey CLx imager | LI-COR Biosciences | for scanning western blot membranes |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Camos, S., Mallolas, J. Experimental models for assaying microvascular endothelial cell pathophysiology in stroke. Molecules. 15 (12), 9104-9134 (2010).
- Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
- Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (9), 2727-2746 (2015).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
- Tornabene, E., Brodin, B. Stroke and Drug Delivery–In vitro Models of the Ischemic Blood-Brain Barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (2), 398-405 (2016).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Llombart, V., et al. Characterization of secretomes from a human blood brain barrier endothelial cells in-vitro model after ischemia by stable isotope labeling with aminoacids in cell culture (SILAC). Journal of Proteomics. 133, 100-112 (2016).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Avdeef, A. How well can in vitro brain microcapillary endothelial cell models predict rodent in vivo blood-brain barrier permeability?. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 43 (3), 109-124 (2011).
- Rahman, N. A., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review. Brain Research. 1642, 532-545 (2016).
- Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9 (6), e99733 (2014).
- Shao, X., et al. Development of a blood-brain barrier model in a membrane-based microchip for characterization of drug permeability and cytotoxicity for drug screening. Analytica Chimica Acta. 934, 186-193 (2016).
- Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).
- Cecchelli, R., et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood–brain barrier. Advanced Drug Delivery Reviews. 36, (1999).
- Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood–brain barrier in drug discovery and development. Nature reviews Drug discovery. 6 (8), 650 (2007).
- Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. . The Blood-Brain Barrier. , 307-324 (2003).
- Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability Studies on In vitro Blood–Brain Barrier Models: Physiology, Pathology, and Pharmacology. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
- Ren, T. B., et al. A General Method To Increase Stokes Shift by Introducing Alternating Vibronic Structures. Journal of the American Chemical Society. 140 (24), 7716-7722 (2018).
- Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).
- Oupický, D., Konák, C., Ulbrich, K., Wolfert, M. A., Seymour, L. W. DNA delivery systems based on complexes of DNA with synthetic polycations and their copolymers. Journal of Controlled Release. 65, (2000).
- Couraud, P. O. . The hCMEC/D3 CELL LINE: IMMORTALIZED HUMAN CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS As a model of human Blood-Brain Barrier. , (2012).
- Youdim, K. u. r. e. s. h. A., A, A. A. a. N. J. In vitro trans-monolayer permeability calculations: often forgotten assumptions. research focus reviews. 8, (2003).
- Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluid and Barriers of the CNS. 10 (33), (2013).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).
- Balda, M. S., Anderson, J. M. Two classes of tight junctions are revealed by ZO-1 isoforms. The American Physiological Society. , (1992).
- Brown, R. C., Davis, T. P. Calcium Modulation of Adherens and Tight Junction Function: A Potential Mechanism for Blood-Brain Barrier Disruption After Stroke. Stroke. 33 (6), 1706-1711 (2002).
- Gorodeski, G., Jin, W., Hopfer, U. Extracellular Ca2+ directly regulates tight junctional permeability in the human cervical cell line CaSki. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 272 (2), C511-C524 (1997).
- Stuart, R. O., Sun, A., Panichas, M., Hebert, S. C., Brenner, B. M., Nigam, S. K. Critical Role for lntracellular Calcium in Tight Junction Biogenesis. Journal of Cellular Physiology. 159, (1994).
- Tobey, N. A. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. , (2004).
- Tobey, N. A., Argote, C. M., Hosseini, S. S., Orlando, R. C. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 286, (2004).
- Posimo, J. M., et al. Viability assays for cells in culture. Journal of visualized experiments : JoVE. (83), e50645 (2014).
- Cipolla, M. J., Crete, R., Vitullo, L., Rix, R. D. Transcellular transport as a mechanism of blood-brain barrier disruption during stroke. Frontiers in Bioscience. 9 (3), 777-785 (2004).
- Kreuter, J. Influence of the surface properties on nanoparticle-mediated transport of drugs to the brain. Journal of nanoscience and nanotechnology. 4 (5), 484-488 (2004).
- Markoutsa, E., et al. Uptake and permeability studies of BBB-targeting immunoliposomes using the hCMEC/D3 cell line. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (2), 265-274 (2011).
